Resumen

Mecanismos de protección contra el estrés osmótico: fosforilación y aumento de p53

El daño del ADN debería activar los mecanismos de reparación normal, por lo que parecía lógico estudiar moléculas que en ese momento eran conocidas como reguladoras y reparadoras del ciclo celular. Con este objetivo, nuevamente se sometió a un cultivo celular a un estrés relativamente suave, con cloruro de sodio, y se midió la cantidad de p53, una proteína antitumoral.

Se observó que cuando las células eran sometidas a estrés hipertónico, la cantidad total de p53 aumentaba de manera rápida y significativa, 6 a 7 veces, aumentando también su fosforilación, proceso necesario para estar activada. Esto es consistente con un respuesta al daño del ADN; es más, frente a un estrés relativamente moderado, la célula se defiende y activa su maquinaria de reparación. En cambio, si el estrés se realiza con urea, no se producen cambios ni en la cantidad ni en la fosforilación de la p53.

P53 es un factor protector contra la apoptosis

Para esta línea celular en particular, y tal vez para otros modelos de estrés osmótico, la activación de p53 es vital para permitir la adaptación a osmolaridades moderadas, en rangos fisiológicos. Para demostrar esto, se transfectaron células con un ADN antisense contra p53 y se midió el porcentaje de células apoptóticas. En la condición control, el antisense contra p53 no tuvo ningún efecto, mientras que en un estrés osmótico moderado, de 500 mosmoles, la apoptosis aumentó de manera significativa en las células transfectadas. Por lo tanto, la p53 es necesaria para lograr la sobrevida bajo un estrés moderado.

Aumento de GADD 45

Posteriormente se estudiaron distintos marcadores para determinar cuáles eran relevantes, así como diversas señales que podrían ser claves para la sobrevivencia. Una de ellas era la proteína GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage inducible 45), cuya respuesta frente al daño por radiaciones era conocida, de modo que era lógico pensar que frente al daño del ADN también podría aumentar.

Con esta hipótesis, se comparó lo que pasaba en la línea celular y en cultivos primarios de médula renal de ratón, para responder a las críticas que señalaban que los cambios descritos ocurrían en una línea celular, pero tal vez no sucederían en un sistema más fisiológico, como las células del cultivo primario, que toleran una osmolaridad de hasta 1600.

El estudio demostró que en ambas líneas se producía un aumento de estas proteínas, que son maquinarias reparadoras de ADN, en particular la isoforma gamma, en forma transitoria y coincidente con el retardo en el ciclo celular, al mantener a las células estimuladas con algún factor de crecimiento, lo que también apoyaba que se producía un daño en el ADN. Así se demostró que durante el estrés hipertónico se activaba una serie de proteínas reconocidas previamente como maquinarias de reparación del ADN.

La inhibición de transportadores de osmolitos causa IRA y necrosis medular

En el mismo laboratorio de Burg, y, sobre todo, en el de David Cohen, se habían caracterizado muy bien los mecanismos fisiológicos que permiten la adaptación al estrés hipertónico en la médula renal, siendo el principal mecanismo la acumulación de los osmolitos orgánicos compatibles, que reemplazan al cloruro de sodio, que se tiende a concentrar cuando la célula está sometida a un estrés hipertónico. O sea, las concentraciones intracelulares de sorbitol, inositol, betaína, etc., aumentan para reemplazar la osmolaridad dada por el cloruro de potasio y de sodio, y como estos osmolitos no son especies iónicas, no alteran la conformación de las proteínas.

El aumento en la concentración de estos osmolitos orgánicos depende, por una parte, de la inducción de transportadores y de sistemas de cotransporte, que son dependientes de sodio y permiten concentrarlos, y por otra, de la inducción de la aldosa reductasa, que transforma la glucosa a sorbitol por inhibición de la glicerofosfocolina fosfodiesterasa, que permite, si se inhibe, la acumulación de la glicerofosfocolina.

Desde 1998, gracias a Kitamura, se sabía que estos mecanismos eran claves para permitir la adaptación al estrés osmótico in vivo e in vitro. Este autor hizo un experimento en ratones a los que se les inhibió el sistema transportador de inositol, lo que se tradujo, 12 a 24 horas después, en una necrosis generalizada del interior de la médula, aunque a nivel externo de ésta no hubo alteraciones, lo que demostró que estos sistemas de transporte fisiológicos eran necesarios para sobrevivir a condiciones hipertónicas, a tal punto que los ratones de este estudio desarrollaban insuficiencia renal aguda y morían a las 48 horas, a menos que se les administrara inositol u otro osmolito orgánico que reemplazara al inositol captado normalmente.

Tonicity Responsive Enhancers (TonE) y TonE Binding Protein (TonEBP)

En ese ambiente, los distintos grupos habían trazado y analizado los genes que codificaban a estos transportadores. En la región 5 prima, es decir, río arriba del inicio del primer exón, se había logrado identificar la secuencia del Tonicity Responsive Enhancers (TonE), una secuencia mínima, que probablemente inhibe a algún factor de transcripción similar a NF Kappa Beta, de la familia de factores Rel, que es absolutamente necesaria para que las células de todas las especies, analizadas hasta 1998, subsistan frente el estrés osmótico.

La identificación de esta secuencia por distintos grupos llevó a éstos a lanzarse a la búsqueda de la molécula que explicara cómo se producía esta adaptación. El grupo de Miyakawa, que fue el primero en aislar esta proteína, realizó un experimento de inmunoprecipitación con un ADN marcado radioactivamente con esta secuencia, aplicando un agente cross-linking que se une covalentemente con la proteína desconocida en un extracto nuclear, de manera fisiológica, en condiciones isotónicas o hipertónicas. Así, demostró que cuando la célula está en condiciones hipertónicas, aparece una proteína que se adhiere al ADN y que pesa alrededor de 200 kD.

Al poco tiempo, el grupo de Handler, utilizando la tecnología del doble híbrido, logró clonar una proteína denominada TonE Binding Protein (TonEBP), que, tal como se había postulado, era un factor de transcripción que se asemejaba, por lo menos en la zona de unión al ADN, a los factores de la familia Rel, al NFAT y al NF Kappa Beta. Es una proteína de 165 kD, que además de tener un dominio de unión al ADN, tiene una serie de sitios de fosforilación, que probablemente cumplen una función regulatoria.

En un artículo de Miyakawa de 1999, se observó la cantidad de RNA en los distintos tejidos, encontrándose en mayor cantidad en riñón, placenta y corazón, en orden decreciente; por lo tanto, la cantidad del RNA mensajero se condice con la función fisiológica que se atribuía este factor de transcripción.

En cuanto a la forma en que se regula esta proteína, se podría esperar, puesto que pertenece a la familia Rel, que este factor de transcripción debiera translocarse al núcleo para regular y activar genes en función del estrés hipertónico. En ese mismo trabajo se mostró cómo las células se inmunomarcaron para TonEBP, en condiciones isotónicas, observándose una marca tenue a nivel del citosol y del núcleo. Así se demostró que, cuando la célula es sometida a un estrés hipertónico, el TonEBP se transloca al núcleo y aumenta su cantidad. Si se realiza un estudio cuantitativo, con Western blot, aumenta la cantidad del TonEBP en respuesta al estrés hipertónico.

Por otra parte, no sólo aumenta la cantidad de TonEBP, sino que también se fosforila, como se demostró haciendo un Inmuno blot para medir la cantidad de TonEBP bajo condiciones hipertónicas e isotónicas, observándose aumentos leves, pero lo más significativo, es que que existe un aumento importante de la fosforilación de estas proteínas. Estudios posteriores sugieren que la fosforilación se correlaciona con la translocación nuclear, y aunque no determina la unión de los distintos genes que regula a esta secuencia específica del ADN, determina de alguna manera su función, porque los sitios de fosforilación del TonEBP van perdiendo actividad protectora contra el estrés osmótico.

Ratones knock out TonEBP

Después de la publicación de Miyakawa, a finales de 1999, se desató una carrera ya que, al mismo tiempo, un grupo que se dedicaba a la inmunología clonó esta misma proteína, le encontró una función dentro del sistema inmune y desarrolló ratones transgénicos.

En los estudios de López-Rodríguez, centrados más en el aspecto renal, se utilizaron ratones knock out para TonEBP o NFAT5-/-, llamados así en el ámbito inmunológico. Son ratones de menor tamaño, lo que sugiere que tiene también un papel en el crecimiento, y tienen una tasa de mortalidad muy alta.

Estos ratones desarrollan un fenotipo renal muy llamativo, a las cuatro semanas, los ratones knock out tienen una papila y una médula atrófica, las células de la médula han perdido su arquitectura normal, se están empezando a agrupar, pierden el aspecto cuboidal y presentan trastornos fisiológicos acordes con una pérdida en la capacidad de concentración de orina. Si se deja que los ratones evolucionen un tiempo más, la médula desaparece totalmente y mueren.

Este estudio demostró que, en el animal knock out, la pérdida de TonEBP induce apoptosis, y que, en estos ratones, los genes que regulan el TonEBP desaparecen, al igual que la aldosa reductasa, que es el mecanismo de acumulación del sorbitol. El transportador de betaína o el de mio-inositol siempre desaparece en estos ratones transgénicos, lo que es consistente con el hecho de que, en condiciones fisiológicas, el TonEBP es clave para regular estos sistemas de acumulación de osmolitos orgánicos.

Genes regulados por TonEBP

A partir del año 2003 se ha producido una explosión de estudios sobre TonEBP, debido a la competencia que existe en el medio inmunológico, en los que se ha evidenciado que esta proteína no sólo regula a los transportadores de osmolitos orgánicos y a la aldosa reductasa, sino que además es capaz de inducir la expresión de la Anti-Heat Shock Protein 70 (HSP70), que es un factor protector, sobre todo frente al estrés producido por urea, que también es letal, y además es capaz de inducir la expresión de los transportadores de urea.

La importancia de esta proteína radica en que es la primera molécula encontrada en mamíferos que actúa como un osmosensor, es decir, que es inducida en respuesta al estrés hiperosmótico y que disminuye cuando el ambiente de la médula renal se torna hipoosmótico, lo mismo que ocurre en el cultivo celular. También regula genes que están relacionados de manera directa con la supervivencia en condiciones de estrés osmótico.

El problema, que no quedó resuelto aquí, es que se sabe que este factor de transcripción regula tres genes, pero se desconoce la señal que activa la función del TonEBP, que es muy rápida, porque entre 15 a 30 minutos ya se puede detectar activación.

El daño al DNA es reparado en condiciones isotónicas

Mientras tanto, en el laboratorio de Burg se planteaba la posibilidad de que el daño al ADN fuera, de alguna manera, una señal que activa a TonEBP, o a alguna señal que, a su vez, activa los mecanismos de protección renal, y para determinar esto, lo primero era determinar en qué consiste exactamente el daño al ADN, si es algo transitorio o si perdura en el tiempo, y si se puede ver en un animal.

En un primer momento, cuando se planteó en el laboratorio hacer un experimento, todos opinaron que no era posible hacerlo, porque en una médula renal normal prácticamente no se produce apoptosis ni proliferación, de modo que se procedió a medir el daño al ADN utilizando el sistema de cultivo primario y la técnica comet, con la que se demostró la presencia de daño y, lo más interesante, se observó que cuando estas células dañadas volvían a una condición isotónica, el daño al ADN era reparado.

El daño no sólo se manifiesta como quiebres en el ADN, si bien es un hecho que se produce con el estrés hipertónico y que puede ser reparado en condiciones isotónicas, sino que también la maquinaria que se activa en función de los quiebres del ADN experimenta un proceso similar.

El estrés osmótico interfiere con los mecanismos de reparación de daño al ADN

Posteriormente se trabajó con la siguiente hipótesis: los quiebres del ADN producidos por el estrés hipertónico deberían persistir mientras se mantenga el estrés, o sea, cualquier estrés o daño del ADN no debería ser reparado en condiciones hipertónicas, porque, de alguna manera, la maquinaria encargada de la reparación se encuentra detenida.

Para comprobar esto, se aplicó radiación ultravioleta, que en condiciones normales produce quiebres en el ADN, a un grupo de células expuestas a estrés hipertónico y a un grupo control, y se midió la proteína Mre11, una de las primeras señales que detecta el quiebre del ADN y se une a esa zona, sirviendo como una especie de bandera para atraer la maquinaria de reparación. En condiciones normales esta proteína es nuclear, y cuando se aplica radiación ultravioleta persiste en el núcleo, pero si se aplica estrés hipertónico, aún en condiciones de daño al ADN, la proteína deja de ser nuclear, y, como se comprobó mediante citometría, pasa al citosol.

Otra señal de que existe daño en el ADN, es la fosforilación de la histona 2AX (H2AX); normalmente, cuando hay quiebres en el ADN, esta histona se fosforila. En este estudio, en la condición control, 10% de las células tenían fosforilación nuclear de esta proteína, mientras que esto ocurrió en el 55% de las células sometidas a radiación ultravioleta; sin embargo, si a continuación del daño por radiación, se aplica estrés hipertónico, se fosforila sólo el 25% de las células.

La conclusión de este experimento es que el estrés hipertónico daña al ADN y, además, detiene una parte de la maquinaria que señaliza el daño y que, probablemente, permite la reparación.

Existen quiebres del ADN in vivo

Si es cierto que esto ocurre, in vivo, en un animal que está siempre en condiciones hipertónicas se debería encontrar daño en el ADN. Para comprobar esto, recientemente Natalia Dmitrieva trató de evidenciar la presencia de quiebres del ADN en la médula de ratones vivos. En una sección de médula trabajada con la técnica comet, en la que se pudo ver núcleos redondeados en la corteza, pero con ”colita” en la médula interna, lo que indica que, en condiciones basales, existen quiebres o zonas de rotura del ADN.

Si la hipótesis basada en los estudios in vitro es verdadera, la manipulación de la hipertonicidad medular debería afectar la cantidad de estas colas; por ejemplo, si se coloca a la médula en un medio hipotónico, debería ser reparada, porque según nuestra hipótesis, es la hipertonicidad lo que detiene el mecanismo de reparación. Para demostrar esto, la autora inyectó furosemida a los animales y demostró que, a medida que pasaban las horas después de esta inyección, la osmolaridad de la médula iba disminuyendo y se iban reparando los quiebres.

También se estudió esto marcando los quiebres en la doble hebra del ADN con un análogo de la timidina, la bromodeoxiuridina (BrdU), con lo que se demostró la presencia de muchos quiebres en la médula del animal control, en contraste con lo que ocurría en la corteza, donde no se detectó este fenómeno.

Además se estudiaron los otros mecanismos de señal que se habían visto con anterioridad en las células de cultivo, por ejemplo, la fosforilación de la histona, utilizando de nuevo la maniobra de tratamiento con furosemida. Se pudo ver que en la médula interna, en condición control, no hay fosforilación, porque no hay daño en el ADN, de manera que el mecanismo de reparación está detenido, pero cuando se administra la furosemida, que permite que la maquinaria comience a funcionar, aparece la fosforilación. En cambio, si se irradian los animales con fracción gamma, en la corteza siempre está activo el mecanismo de reparación.

También se analizó con Western blot, para tener una medición más cuantitativa de la fosforilación. Además, cuando hay muchos quiebres del ADN, se produce reparación sintetizando hebras nuevas, por lo tanto, esta síntesis podría verse afectada en condiciones de hipertonicidad. Esto se estudió irradiando los riñones con radiaciones gamma para producir más quiebres en el ADN, comprobándose la síntesis reparativa, que se marca con BrdU, luego de la administración de furosemida. En la corteza siempre hay reparación, porque no hay hipertonicidad, por lo que el mecanismo funciona con normalidad.

La conclusión de estos estudios es que en animales en condiciones normales, in vivo, sin que exista apoptosis, ocurre daño del ADN, y que los mecanismos de regulación son modulados en función de la hipertonicidad.

La siguiente pregunta es, si se puede relacionar este daño al ADN con la activación del TonEBP, que aparentemente es la molécula clave, como factor de transcripción, para permitir la adaptación, al menos mediante la acumulación de los osmolitos orgánicos y las Heat Shock Proteins.

Kultz, antes de que se demostraran quiebres en el ADN de la médula, utilizó el LY294002, un inhibidor de proteína quinasa, en un trabajo que publicó en el año 2002. Este inhibidor potencia el daño al ADN en células de cultivo, y por otra parte, las células en condiciones hipertónicas moderadas bloquean esta serie de quinasas, aumentando en el tiempo la proporción de células con daño en el ADN, lo que sugiere que la activación de estas quinasas está relacionada, de alguna manera, con los mecanismos de reparación y/o de supervivencia.

Por distintas razones, y basados en estudios preliminares, en el laboratorio de Burg se interesaron en la proteína quinasa llamada ataxia telangiectasia mutada (ATM), que se activa para la reparación del ADN.

ATM se activa por hipertonicidad

Se presentarán los resultados de un trabajo del Dr. Carlos Irarrázabal, cuya hipótesis era que la hipertonicidad debería activar la quinasa, que es una de las señales que se activan cuando ocurre daño en el ADN, y esta activación se mide como fosforilación, ya que es una proteína que se autofosforila cuando se activa. La condición hipertónica con cloruro de sodio aumenta la fosforilación, al igual que la radiación ionizante, mientras que la urea y la radiación ultravioleta producen una activación menor.

Al relacionar la activación de esta quinasa con la actividad del TonEBP, a pesar de que varios estímulos activan esta quinasa, se pudo ver que sólo el estrés hipertónico activa la función del TonEBP, indicada por la actividad relativa de ORE.

Este inhibidor inhibe a esta quinasa y también a Wortmannin, otro inhibidor no muy selectivo, pero que es activo contra esta quinasa. Con esta base, se realizó un experimento farmacológico para ver si esta quinasa estaba implicada en la función del TonEBP. De nuevo se transfectaron células con un ORE, de modo de tener una medida cuantitativa de la actividad de este factor de transcripción, comprobándose que el estímulo del estrés hipertónico incrementa tres mil veces la actividad de TonEBP, mientras que, al usar Wortmannin en concentraciones crecientes, se va bloqueando el aumento de la actividad del TonEBP inducido por la hipertonicidad, lo que sugiere que ATM estaría involucrado, al menos en forma parcial, en la activación de TonEBP.

Para determinar lo que sucede con la activación de TonEBP en células que carecen de la proteína ATM, se utilizaron células de animales knock out para esta proteína, las células AT, las que fueron transfectadas con el ORE, observándose que la actividad de TonEBP estimulado por el estrés hipertónico aumentaba notablemente, es decir, la activación de TonEBP sin ATM es mucho menor.

La conclusión de estos experimentos es que una de las quinasas importantes para que se active TonEBP, medido con la actividad de este ORE reportero, es ATM, lo que es relevante, porque esta quinasa se activa con los quiebres en el ADN. En suma, es probable que el daño que se produce en el ADN en condiciones hipertónicas estimule a ATM y que sea esta molécula la que active a TonEBP.

Uno de los requisitos para que este enunciado sea cierto, es que esta quinasa fosforile directamente al TonEBP. Para demostrar esto, se hicieron experimentos de inmunoprecipitación que demostraron que no sólo existe correlación entre la activación de TonEBP, presencia de ATM y fosforilación, sino que además, éstos están físicamente asociados en distintos modelos celulares.

Resumen

Se ha aprendido bastante sobre los mecanismos de adaptación al estrés osmótico inducido por cloruro de sodio; la molécula clave, hasta el momento, es TonEBP, que podría ser activado por los quiebres del ADN que se producen en condiciones fisiológicas.

Además existen otras quinasas, aparte de ATM, como la fosfatidil inositol 3 quinasa (PI3K), probablemente otras moléculas de la misma familia quinasa y la MAP quinasa p38, que de alguna manera potencian la actividad de TonEBP, y, en forma similar a lo que sucede en las células AT, el bloqueo de una de ellas no liquida la actividad, pero la disminuye de manera notoria.

Existe una diferencia entre la adaptación al estrés hipertónico entre los mamíferos, por lo menos en las células de la médula renal, las plantas y los organismos unicelulares, en los que existe un osmosensor. Al parecer, los mamíferos no tendrían un osmosensor como tal; en ellos no existiría un mecanismo de traducción ni una quinasa dedicada a medir la osmolaridad directamente, sino que el daño al ADN o a otra estructura, activaría los mecanismos adaptativos.

Lo que aún se desconoce, es cómo y qué hace la urea. Está claro que la adaptación al estrés por urea requiere de la activación de la HSP70, pero no se sabe si la urea provoca daño, o más bien funciona como un factor adaptativo. En el laboratorio de Cohen se ha demostrado que la vía del factor de crecimiento epidermal y de otros factores de crecimiento se activa sin agonistas en presencia de urea, lo que lleva a plantear que esta sustancia es más bien un factor protector cuando se asocia al cloruro de sodio, pero esto es lo contrario de lo que piensan otros investigadores.

Tampoco está claro cuáles podrían ser las cascadas, porque se ha comprobado que también se activan factores de transcripción prosupervivencia más que proapoptóticos, por lo que el campo de la urea está mucho más atrasado.

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