Resumen

Los modelos animales de esteatohepatitis han sido fundamentales para avanzar en el conocimiento de la enfermedad.

Al parecer la esteatosis evoluciona hacia esteatohepatitis y desde ese estado avanza, finalmente, hacia la cirrosis. Lo que no se sabe es por qué algunas personas permanecen con hígado graso, mientras que otras avanzan hacia etapas más graves de la enfermedad. Para explicar los distintos estados a los que pueden llegar los pacientes que comienzan con un hígado graso, varios investigadores han propuesto una explicación conocida como hipótesis de los impactos múltiples.

Hipótesis de los impactos múltiples
Según esta teoría, alguna lesión afectaría el hígado normal y desencadenaría la acumulación de grasa en él. Esta lesión debe de ser producida por algo muy frecuente, porque existe una gran cantidad de personas afectados por hígado graso.

El hecho de que un paciente con hígado graso evolucione hacia una enfermedad más grave dependerá de la exposición a una segunda agresión o impacto, que va a iniciar el desarrollo de esteatohepatitis y la evolución hacia cirrosis se producirá en presencia de un tercer o cuarto impacto. Lo anterior explica la evolución variable de la enfermedad, pues ésta dependerá del agregado de dichas agresiones sobre la primera, que causó el hígado graso.

Esta teoría es difícil de probar en seres humanos, porque lo más frecuente es que ellos lleguen al médico en etapa de hígado graso. De ahí la importancia de desarrollar modelos animales para estudiar esta teoría y determinar su validez.

El primer modelo utilizado fue el del ratón obob, que tiene una mutación en el gen que codifica leptina, hormona que regula el comportamiento alimentario de los animales. Este animal no puede producir leptina, por lo que se sobrealimenta, se pone obeso y desarrolla muchas características comunes con los pacientes que tienen hígado graso no alcohólico, quienes suelen ser diabéticos tipo 2 o dislipidémicos. Estos animales también tienen hígado graso, el que se traduce histológicamente en una esteatosis macro y microvesicular que se produce en forma natural.

Este animal es un modelo experimental muy conveniente para verificar la hipótesis planteada. Una vez que se ha desarrollado el hígado graso, algo lo torna vulnerable a una segunda agresión que desencadena la inflamación, como la exposición a lipopolisacáridos (LPS) o a endotoxinas.

Mecanismo de acción de la endotoxina
En el trabajo que estamos realizando con este modelo, se les inyecta a los ratones obob una pequeña dosis de endotoxina para producir esteatohepatitis y determinar por qué el animal presenta ese tipo de lesión hepática. El ratón silvestre, que no tiene hígado graso, no desarrolla un compromiso histológico manifiesto y muestra un escaso aumento de las enzimas hepáticas después de recibir las endotoxinas; en cambio, el ratón obob presenta inflamación hepática, lesión de los hepatocitos y gran alteración enzimática, lo que da a entender que algún factor presente en el hígado graso lo hace propenso a desarrollar daño grave cuando se ve expuesto a una minúscula dosis de endotoxina, que no causa daño en hígados normales.

Otros estudios habían demostrado que la endotoxina lesiona el hígado por medio de un mecanismo relacionado con el factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa), por lo que se preveía que los animales obesos producirían mayor cantidad de este factor, pero se observó que cuando el animal normal recibía una inyección de endotoxina, fabricaba una gran cantidad de TNF sin que se produjera daño hepático, mientras que el animal obeso producía menos TNF que el animal magro, a pesar de lo cual presentaba compromiso hepático. Este hecho demostró que en el hígado graso hay algo que hace que los hepatocitos sean más vulnerables a las lesiones debidas a TNF, de modo que cuando se exponen a un estrés inflamatorio que aumente aunque sea un poco el nivel de TNF, como la endotoxina, presentan esteatohepatitis.

Anteriormente se había demostrado que la viabilidad de los hepatocitos está regulada por productos que fabrican las células no parenquimatosas del hígado, como las células endoteliales, los astrocitos, los macrófagos y los linfocitos. Investigadores japoneses, en un intento de aclarar cómo estas células no parenquimatosas regulan la sensibilidad del hígado frente a las endotoxinas, demostraron que los hígados se vuelven más sensibles a las endotoxinas cuando carecen de cierto tipo de linfocitos llamados CD4 NKT, que son los linfocitos predominantes en el hígado y que regulan el sistema inmune innato. Las células hepáticas carentes de estos linfocitos quedan muy susceptibles a que las endotoxinas las eliminen, porque ya no pueden fabricar citoquinas del linfocito TH2, como la IL-10, que inhibe la toxicidad del TNF.

El hígado del ratón obob, efectivamente, se encuentra carente de células CD4 NKT y por eso, cuando se le pone frente a lipopolisacáridos, no fabrican más TNF que los animales magros y producen mucho menor cantidad de IL-10, que es precisamente lo que estas células CD4 NKT regulan. Así se explica por qué son más sensibles al LPS y por qué desarrollan NASH (non-alcoholic steatohepatitis) o esteatohepatitis no alcohólica.

Nuestra línea de investigación actual está orientada a entender qué es lo que causa la desaparición de las células CD4 NKT del hígado de los ratones obob; estamos verificando la hipótesis de que algo así como una deficiencia de leptina es lo que causa esta carencia, posiblemente porque afecta las células de Küpfer. En los últimos años se ha demostrado que la leptina es una hormona inmunomoduladora muy potente, que no sólo afecta el comportamiento alimentario, sino que también tiene muchos efectos sobre el sistema inmune.

Rol de las células de Küpfer en el agotamiento de células CD4
Las células de Küpfer tienen receptores para la leptina, que también se llama OB, y producen citoquinas como las interleuquinas 15, 12 y 18, las que regulan la viabilidad de las células CD4 NKT. La IL-12 y la IL-18 inhiben su viabilidad y la IL-15 las protege y les permite expandirse, porque inhibe su apoptosis.

Una serie de experimentos ha permitido establecer que el ratón obob carente de CD4 NKT no produce IL-15 en el hígado, lo cual podría contribuir al agotamiento de linfocitos CD4, que a su vez conduce a niveles bajos de IL-10. Cuando el animal está expuesto a LPS no puede protegerse frente al TNF, de modo que sufre daño hepático y sensibilidad al LPS. La administración de leptina en estos animales, mediante mini bombas subcutáneas, puede aumentar la producción hepática de IL-15, los niveles de linfocitos CD4 NKT y la IL- 10, protegiendo a los individuos del daño por LPS.

Aunque ya se sabe más sobre las alteraciones del sistema inmune, todavía no está claro por qué los hepatocitos mueren.

Papel del TNF alfa
Otros investigadores han estudiado de qué manera el TNF alfa elimina las células hepáticas. El TNF interactúa con los receptores presentes en la superficie de las células y entrega señales que afectan las mitocondrias, de manera que éstas expresan proteínas de la familia BCL2, como BAX, que actúan como poros y permiten que escapen partes de la cadena de transporte de electrones, como el citocromo C. Cuando esta cadena se altera, las mitocondrias fabrican más especies reactivas de oxígeno y éstas, junto con el citocromo C, contribuyen a la activación de caspasas que llevan a apoptosis.

Nosotros hemos tratado de determinar si estos procesos también se producen en el hígado de las ratas obesas. La proteína BAX, que es un miembro proapoptótico de la familia BCL 2, tiene baja expresión en los hepatocitos normales y sólo a nivel de la vena hepática terminal; sin embargo, al administrar dosis bajas de alcohol a animales normales, éstos empiezan a expresar BAX difusamente, sobre todo alrededor de la vena hepática; en los ratones obob la expresión es mucho más intensa y se extiende a lo largo de todo el lobulillo hepático, lo que indica que estas mitocondrias ya comenzaron a participar en la muerte celular por la apoptosis.

Cuando el canal BAX se abre, el citocromo C escapa de las mitocondrias; por eso, las mitocondrias de los ratones obesos tienen menos citocromo C. El escape del citocromo C altera la cadena de transporte de electrones e inicia la formación de aniones de superóxido. Las mitocondrias tienen una enzima que se llama superóxido-manganeso-dismutasa, que convierte los superóxidos en peróxido de hidrógeno.

Si las mitocondrias de los ratones obob pierden citocromo C, deberían formar más aniones de superóxido y deberían tener mayor actividad de superóxido-manganeso-dismutasa, porque los aniones superóxido inducen la formación de la enzima, formando más peróxido de hidrógeno. Efectivamente, se demostró que las mitocondrias de los animales obesos tienen más cantidad de esta enzima.

El peróxido de hidrógeno se puede detectar en una probeta mediante una reacción con la sonda luminol, que genera luz en presencia de peróxido de hidrógeno. Las mitocondrias de los ratones obesos liberan más luz, porque generan más peróxido de hidrógeno, lo que significa que están activando los espacios para causar muerte celular. Sin embargo, en los animales magros tratados con LPS se activa la caspasa 3 y en los animales obesos, a pesar de tener mayor daño hepático después de recibir LPS, esto no ocurre.

La pregunta, entonces, es por qué estas mitocondrias anormales no activan las caspasas. Una posibilidad es que se protejan de alguna manera contra el citocromo C mediante alguno de los posibles mecanismos protectores, como la up-regulation (sobrerregulación) del factor de transcripción NF Kappa B, que regula la transcripción de los miembros protectores de la familia de BCL 2, como BCLXL. Los animales magros expuestos a LPS inducen este factor de protección en forma transitoria; en cambio, los obesos tienen una inducción más robusta y sostenida.

Con respecto a la expresión de los miembros protectores de la familia de BCL 2 en animales magros y obesos expuestos a etanol, en ambos modelos de hígado graso hay mayor cantidad de BAX y BCLXL.

Otra proteína mitocondrial que se puede inducir en respuesta a agentes oxidantes, para disminuir la producción de éstos en un intento de proteger la mitocondria, aparte del BCLX y la superóxido-manganeso-dismutasa ya mencionados, es la proteína desacopladora 2 (UCP 2), que corresponde a una proteína de la membrana mitocondrial, la que actúa como poro para los iones de hidrógeno, disipa las gradientes electroquímicas que normalmente se producen durante el transporte electrónico y rebajan el potencial de membrana en la membrana mitocondrial, con el fin de reducir la eficiencia de la síntesis de ATP; esto último predispone a la necrosis celular.

No obstante, también reduce la cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se producen durante la actividad de la cadena de transporte de electrones. Si éste fuera un mecanismo protector, el aumento de la producción de oxígeno produciría un aumento de la proteína desacopladora 2 (UCP 2).

Para verificar esta teoría, los hepatocitos de las ratas fueron tratados con una droga llamada BPQ, que aumenta la producción de ROS en las mitocondrias, lo que indujo una mayor expresión de UCP 2. Las mitocondrias de los hepatocitos normales expresan poca UCP 2, pero si se tratan con esta droga BPQ para aumentar la producción de peróxido de hidrógeno, la UCP 2 aumenta.

Por lo tanto, la UCP 2 es una proteína que se sobreexpresa en presencia de oxidantes y que existe en mayor cantidad en el hígado de ratones obob, a nivel del RNA. En colaboración con Hook, del Thomas Jefferson, hemos podido demostrar que efectivamente causa el desacoplamiento de la membrana interna mitocondrial. Esto significa que si la UCP 2 está activa, la síntesis de ATP es menos eficiente. De hecho, se han medido niveles de ATP menores en hepatocitos aislados de ratas OBOB.

Esto llevó a plantear que en presencia de TNF, que también disminuye el potencial de membrana, en vez de morir por apoptosis debido a un mecanismo mediado por caspasas, estas células podrían morir por necrosis, en cuyo caso se romperían, liberando LDH hacia el medio. Entonces se trataron células magras con TNF y se midió la liberación de LDH hacia el medio, la que fue escasa o nula; en cambio, al tratar con TNF las células de ratones obesos, carentes de ATP, se liberaron grandes cantidades de LDH.

En resumen, los estudios en modelos animales señalan que el hepatocito es normal al inicio, probablemente, pero cuando el animal se torna obeso y tiene trastornos inmunológicos, el sistema inmune del hígado genera citoquinas que ejercen algún tipo de presión apoptótica sobre los hepatocitos y éstos comienzan a presentar adaptaciones que involucran las mitocondrias e interfieren en el metabolismo normal de las grasas.

Una de las adaptaciones consiste en sufrir degeneración grasa, pero hay otras; por ejemplo, las mitocondrias participarían en la apoptosis y matarían la célula, pero, cuando ésta se adapta excesivamente, sobrerregula otras proteínas mitocondriales y logra permanecer viva, aunque con degeneración grasa. Sin embargo, algunas de estas adaptaciones, como las alteraciones de la proteína desacopladora, pueden convertirla en vulnerable frente a la necrosis.

Conclusiones

En primer lugar: lo que no mata, fortalece. Es decir que estas células se adaptan a las presiones apoptóticas y sobreviven, de modo que el hígado graso sería una adaptación lograda frente el estrés.

Segundo, algunas de estas adaptaciones, como la proteína desacopladora, podrían dejar la célula más vulnerable a otro estrés, como la necrosis.

En tercer lugar, haga lo que hiciere, el individuo sale mal parado. Si no se adapta para protegerse de la apoptosis, ésta lo mata; pero, si se adapta frente a la apoptosis, igual va a morir por necrosis. Esto significa que es la suerte la que manda.

La hipótesis de los impactos múltiples plantea que el hígado graso es un estado adaptativo. Si la segunda agresión no llega, la inflamación no avanza y el paciente puede vivir mucho tiempo más, pero si la célula hepática se expone a otro estrés que rebaja el potencial de membrana un poco más, queda propensa a morir y a sufrir de esteatohepatitis.

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