Resumen

El citomegalovirus (CMV) se clasifica hoy en día dentro de la familia de los virus herpes, acompañado, dentro de ella, por virus que son bastante conocidos, por lo menos los cuatro primeros. Los otros tres son de descubrimiento más reciente, por sus asociaciones con cuadros clínicos, como el herpes 6 y 7, que están relacionados con exantema súbito. Probablemente infectan linfocitos y producen una infección sistémica. El virus herpes 8 fue relacionado hace poco con el virus herpes que produce el sarcoma de Kaposi. La clasificación virológica de esta familia reconoce tres grupos, lo que es importante conocer: el CMV se encuentra en el grupo de los beta; con el primero de ellos, el herpes simplex 1 y 2, tenemos mayor familiaridad, por la alta incidencia y prevalencia de las infecciones que causa. Junto con el virus varicela, estos tres virus tienen la particularidad, como toda la familia, de establecer latencia luego de producir una infección primaria, pero es una latencia bastante localizada, porque permanecen en células del sistema nervioso. El otro grupo de esta familia corresponde a virus bastante más ubicuos en el organismo. Después que producen la infección primaria, infectan, de forma crónica o latente, linfocitos, monocitos, macrófagos y probablemente células endoteliales. Es el grupo en el cual están los virus de Epstein-Barr (EBV) y el del sarcoma de Kaposi. Se podrían caracterizar porque, además de los cambios líticos que producen en la célula, se relacionan con una eventual transformación maligna de ella.

Lo que interesa destacar de este virus es que su genoma contiene DNA y, en lo que se relaciona con el diagnóstico, produce una serie de proteínas. Estas proteínas se clasifican en tres tipos: las proteínas que se producen inmediatamente después de la infección de una célula, relacionadas con la transcripción del genoma del CMV; las proteínas tempranas, que van a cumplir la función de síntesis del DNA viral; y las proteínas tardías, que son las proteínas estructurales del virus. Estas proteínas aparecen, respectivamente, a las dos horas, a las ocho horas y a las dieciséis horas post infección. Desde el punto de vista diagnóstico, si se espera a que el virus llegue a producir proteínas estructurales y daño en la célula que infecta, es probable que se deba esperar algunos días para ver histológicamente un daño celular. Sin embargo, si se producen anticuerpos monoclonales contra las proteínas tempranas o inmediatamente tempranas, se podría detectar muy precozmente la infección celular.

La infección latente, característica de los virus herpes, puede reactivarse con cierta periodicidad. Con el CMV estas reactivaciones tienen una particularidad que lo distinguen de los otros virus herpes, cual es el diseminarse por vía hematógena y afectar múltiples órganos.

Se han producido novedades recientes en algunos aspectos de la infección por CMV. Por ejemplo, se han caracterizado bastante mejor los síndromes en pacientes inmunocompetentes y hay también una caracterización mucho mejor de los síndromes en inmunocomprometidos. En los casos de transplantados, se ha aclarado la variación que existe de acuerdo a la población de pacientes, especialmente según el tipo de transplante, y de la intensidad y tipo de tratamiento inmunodepresor. Hay numerosos métodos nuevos de diagnóstico y seguimiento de la infección, que facilitan la apreciación clínica, la apreciación de riesgo de la enfermedad y el análisis de eficacia de los tratamientos. Finalmente, hay nuevas estrategias de intervención, biológicas, como las inmunoglobulinas (Ig), y farmacológicas, como el ganciclovir o el foscarnet, en esquemas o estrategias preventivas o de tratamiento.

Prácticamente, todos los pacientes que tienen inmunodepresión son susceptibles a enfermedad por CMV. A ello se dedica este trabajo, casi obviando la otra población de alto riesgo e importancia, como son las mujeres embarazadas, los fetos y los recién nacidos. A pesar de que, prácticamente, todos los inmunodeficientes son susceptibles a una infección por CMV, problema importante que puede limitar el éxito de un procedimiento, en la mayoría de ellos el comportamiento de la infección es variable. Por ejemplo, en los pacientes VIH (+), sobre todo en los que tienen inmunodeficiencia profunda, con recuento de linfocitos CD4 bajo 50/mm3, se comporta como una infección crónica progresiva. En los pacientes con leucemias o linfomas en tratamiento con quimioterapia, la infección produce reactivaciones sintomáticas durante las etapas de inmunodepresión máxima. Los pacientes transplantados tienen el período de mayor incidencia de infección sintomática o enfermedad por CMV a partir de las cuatro semanas postransplante. Esta enfermedad es más grave si previo al transplante el paciente es seronegativo para CMV y se produce una infección primaria, y en general es más grave en los receptores de médula ósea que en los receptores de órganos sólidos.

Manifestaciones clínicas
Los síndromes son múltiples, como ya se mencionó. Tanto la infección primaria como la infección recurrente pueden afectar múltiples órganos y las manifestaciones clínicas pueden comprometer, prácticamente, todos los sistemas del organismo. Se puede manifestar como neumonía, como depresión de médula ósea, como retinitis (especialmente en VIH(+)), como hepatitis, como enfermedad gastrointestinal o como meningoencefalitis. En los transplantes de órganos sólidos puede afectar también el órgano transplantado. En la población de transplantados, varios estudios indican que alrededor de 50% de los receptores de transplantes, en algún momento postransplante, excretan CMV. Esto significa que hay una replicación activa, una reactivación del virus durante los seis meses postransplante. La incidencia de enfermedad, analizada en todos los pacientes con infección por CMV, presenta cierta variación según el órgano transplantado y según los estudios que se consideren. Por ejemplo, la incidencia de enfermedad por CMV, en ausencia de intervención profiláctica, es de 8 a 32% en el transplante renal. En el transplante de hígado es un problema frecuente, como lo es también en el de corazón, y aumenta un poco en el de corazón + pulmón. En el transplante de médula ósea, aproximadamente en 35% de los pacientes se puede documentar, en algún momento postransplante, una infección sintomática por CMV, que no siempre es diseminada, pudiendo ser localizada.

En cuanto a los factores de riesgo de infección en los transplantados, el más importante es el estado serológico o de exposición previo al transplante. Entre los patrones de infección que se reconocen está la infección primaria, en el paciente seronegativo que no ha tenido exposición previa al virus; la reactivación de la infección latente, en los pacientes que han tenido la infección antes, identificada por métodos serológicos; y, si bien no es un problema frecuente, se ha documentado en forma bastante clara la existencia de reinfecciones con otra cepa de CMV, ya sea a partir del órgano transplantado, o bien de los productos sanguíneos que estos pacientes necesitan postransplante.

Métodos diagnósticos
Desde el punto de vista diagnóstico, hay cinco aspectos que se analizarán brevemente: la serología, tanto IgM como IgG, que sigue siendo un arma importante en dos circunstancias: primero, para medir la exposición previa de un paciente, en especial el que va a ser sometido a inmunosupresión, en que es importante la existencia de IgG como indicador de infección previa; y, segundo, en el paciente inmunocompetente, en que la IgM sigue constituyendo un buen marcador de infección aguda. La serología sigue siendo importante para determinar si un paciente está cursando una infección aguda por CMV.

Con respecto al cultivo, todos conocemos bastante bien el cultivo tradicional y el de aparición más reciente denominado Shell-Vial. En el cultivo convencional, la presencia del virus se detecta por la demostración del efecto citopático. Este se manifiesta como el “aglobamiento” focal de las células, habitualmente fibroblastos, en cultivo, con el efecto citopático característico del CMV. Este efecto citopático se observa, en promedio, diez días después de la inoculación de la muestra, con un rango de 4 a 28 días. Evidentemente, la oportunidad con la que se informan los resultados del cultivo es bastante retrasada respecto a las necesidades clínicas, especialmente en pacientes inmunocomprometidos.
La siguiente técnica desarrollada fue la producción de monoclonales contra las proteínas inmediatas y tempranas, para detectar la presencia de las fases iniciales de la replicación viral en el núcleo de las células en cultivo. Esta técnica utiliza los mismos fibroblastos del cultivo, colocados sobre cubreobjetos redondeados, los que se colocan en el fondo de un tubo, haciendo crecer los fibroblastos igual que en los tubos convencionales. Se inocula la muestra, tras lo cual se centrifuga, de manera que las partículas virales y las células infectadas forman una monocapa. A las 16 horas de incubación, se extrae el cubreobjetos, sobre el cual están las células en las que se inoculó la muestra, se tiñe con azul para distinguir las células, y se realiza la tinción con anticuerpos monoclonales contra proteínas tempranas. El efecto que se observa es que los fibroblastos aparecen totalmente sanos histológicamente, pero, al teñir con anticuerpos monoclonales contra proteínas tempranas, se ve que, al menos en parte, estas células están infectadas con CMV. Este examen es totalmente limpio, con muy poco background de inmunofluorescencia. Se distingue la presencia del CMV por la especificidad del anticuerpo monoclonal y porque en las células (vistas con el microscopio de luz) se tiñe exclusivamente el núcleo, que es donde ocurren las fases tempranas de replicación del CMV. Por lo tanto, este es ya un primer avance, porque en 16 a 24 horas el laboratorio puede informar un cultivo positivo de prácticamente cualquier muestra, que puede ser LCR, sangre, orina, biopsia, etc.

Sin embargo, la ubicuidad del CMV en la población hace que el cultivo pierda su eficacia como arma diagnóstica, porque se puede encontrar replicación del CMV en muchos procesos patológicos y es difícil encontrar la asociación causal con el proceso que se está estudiando en el paciente.

El problema se puede graficar de esta forma: en muchos pacientes, el virus está latente, presente en numerosas células, especialmente células de la línea monocitaria circulantes. De este estado de latencia, en el cual el DNA esta incorporado en las células, el virus puede pasar a un estado de replicación baja, que muy rara vez se expresa clínicamente. De este bajo estado de replicación, que generalmente ocurre en neutrófilos, pasando de ellos a otras células del organismo como glándulas salivales, riñón, y otros órganos, el virus puede pasar a un nivel alto de replicación, el que sí se hace clínicamente significativo, y conduce a enfermedad por CMV.

Por tanto, los métodos de diagnóstico, en especial en pacientes críticos, en los que hay que precisar el papel que tiene el CMV en su estado patológico actual, deben ser capaces de demostrar, en forma específica, cuándo el CMV está con un nivel alto de replicación, clínicamente significativo. Por otra parte, aun con un bajo nivel de replicación, como por ejemplo un paciente con virus latente, un hemocultivo eventualmente puede salir positivo, en la medida que las células con infección latente se activen. También sucede lo mismo con la técnica de PCR en pacientes con nivel bajo de replicación y virus latente en las células circulantes periféricas o en biopsias. La PCR cualitativa detectará bajo nivel de replicación. Por lo tanto, el cultivo, y la PCR cualitativa positivos, en estos estados, no diferencian el alto nivel de replicación que interesa para asociar con las manifestaciones clínicas.
Para estos propósitos se cuenta con la antigenemia y la detección cuantitativa de ácidos nucleicos. Para realizar la antigenemia se toma una muestra de sangre, se cuenta el número de glóbulos blancos que se observan y, posteriormente, se tiñe con un monoclonal muy similar al que se usa para el Shell-Vial. Este monoclonal va a detectar las células que se están replicando o están produciendo proteínas del virus en forma activa. Por lo tanto, cuando se hace antigenemia, lo que se detecta a partir de la muestra de sangre, es virus que se está replicando en forma activa. Si se compara la sensibilidad de este examen respecto a los convencionales, como el hemocultivo y el cultivo Shell-Vial en tubo, se observa que la sensibilidad de la antigenemia para detectar a los pacientes que están replicando activamente el virus es mucho mayor que en los dos métodos de cultivo. Esta observación corresponde a un estudio de pacientes oncológicos hecho en nuestro laboratorio.

Tanto la antigenemia como el estudio de la carga viral y los métodos de ingeniería molecular para la detección del virus tienen los siguientes usos potenciales: 1) predicción de evolución clínica y 2) monitorización de terapia en cuanto a respuesta y resistencia.

Respecto al primer punto, no sólo interesa saber si un paciente tiene el CMV, porque en Chile 80% de las personas lo tiene. Lo que interesa es saber si ese determinado paciente está replicando el virus y, si es así, cuál es la intensidad de la replicación; de tal manera de predecir si esa infección, que está evolucionando en el paciente, va a ir a la producción de manifestaciones clínicas. En este sentido se han hecho trabajos sobre el valor predictivo que tiene la antigenemia y la detección de ácidos nucleicos. En general son buenos predictores, es decir, estos exámenes positivos en pacientes de riesgo predicen con bastante acierto quiénes van a enfermar por el virus, con ciertas salvedades que se mencionarán mas adelante.

Por otra parte, cuando hay una intervención terapéutica con las herramientas disponibles, es sumamente útil disponer de métodos que permitan determinar, además de la evolución clínica del paciente, si se está controlando adecuadamente la infección, desde el punto de vista de la carga viral del paciente. Además, la medida en que el virus del paciente se sigue replicando, a pesar de la terapia, es una forma barata y eficaz de determinar la resistencia viral, sin entrar en métodos más complejos de detección de sensibilidad.

La antigenemia es un método bastante rápido, que demora de seis a veinticuatro horas. Entrega un resultado cuantitativo. El laboratorio informa el número de neutrófilos o de núcleos que se ven positivos con relación a un total de células, generalmente 50.000 o 100.000 células. Ese resultado es comparable con el de otros laboratorios y es comparable con los resultados obtenidos en el mismo paciente antes o después del tratamiento, o para seguimiento de una infección que no ha recibido terapia. Es más sensible que los métodos de cultivo tradicionales y se necesitan menos leucocitos que para los cultivos. Sin embargo, sigue existiendo un factor limitante, ya que se necesitan suficientes células blancas para detectar los núcleos infectados, lo que puede representar un problema en pacientes inmunodeficientes y en los casos pediátricos esto puede llegar a representar un problema, especialmente si existe una neutropenia importante. El examen tiene un valor pronóstico, y puede permanecer positivo bajo efecto de antivirales. Aunque se estén administrando antivirales, esta técnica sigue siendo eventualmente útil para detectar replicación viral activa durante algunos días.

Con respecto a la determinación de carga viral de CMV, incluso aquellos métodos de genética molecular que determinan la presencia de ácido nucleico del CMV, el tiempo de resultado es menor, aproximadamente de seis horas. Es muy flexible, ya que no hay necesidad de transportar ni procesar la muestra inmediatamente. A diferencia de la antigenemia, la muestra se puede guardar en el mesón por algunas horas, ya que el DNA es una molécula bastante estable y soporta algunas horas sin procesar. Es un método con estandarización objetiva y reproducible, y su sensibilidad y especificidad están dirigidas a determinar infecciones clínicamente significativas. Es decir, no es demasiado sensible como para entregar muchos falsos positivos. Se ha establecido una sensibilidad analítica de aproximadamente 1.000 copias/ml.

Entre los métodos genómicos para determinar carga viral, hay cuatro disponibles comercialmente. En la Clínica Alemana se utiliza la amplificación isotérmica que detecta mRNA llamado NASBA. En la Universidad de Chile y la Universidad Católica se utiliza la amplificación por PCR llamada Amplicore CMD, de Roche. También se usa en Chile el Branch-DNA distribuido por Biochile. Los tres métodos son bastante comparables desde el punto de vista del comportamiento clínico.

En nuestro servicio se han realizado algunas comparaciones que, si bien el número de pacientes no es muy grande, son ilustrativas en cuanto a la utilidad y las limitaciones de estas técnicas.

Se observa que la antigenemia detecta todos los pacientes que se enferman, es decir tiene 100% de sensibilidad. Sin embargo, aproximadamente en 46% de los casos que no desarrollan la enfermedad se ve antigenemia positiva. Esto obliga a determinar umbrales que permitan establecer sobre qué número de células positivas el paciente sí va a enfermar. Respecto a eso, hay bastantes protocolos clínicos y trabajos publicados. Hay bastante variación entre los resultados: por ejemplo, una antigenemia positiva con 2 núcleos positivos en 200.000 células es significativa en un transplante de médula ósea. Se señala que en el transplante de MO, casi cualquier antigenemia positiva es predictiva de que el paciente va a desarrollar una enfermedad. En el trasplante de riñón se establece un límite un poco más alto y en el de hígado y corazón, aún más alto que en los anteriores. En estos casos, aparentemente, se requiere bastante más replicación del virus para tener un efecto clínico.

En los casos VIH(+), que son los pacientes en quienes más estudios se realizan, se ven las antigenemias más altas, sin compromiso clínico detectable en el examen físico habitual.
Con respecto a la carga viral, con más o menos el mismo número de pacientes estudiados, la técnica detecta a casi todos los pacientes que se enferman, con una sensibilidad de 90%. Sin embargo, gracias al punto de corte analítico, no detecta casos positivos que no enferman; por lo tanto, si bien aparece con menor sensibilidad, tiene una mayor especificidad. Es bastante difícil definir, entre ambas, la prueba ideal, y probablemente se necesiten más estudios para familiarizarnos mejor con cada una de estas técnicas en nuestro grupo de pacientes.

Tratamiento
A veces las infecciones por CMV no se controlan con las medidas terapéuticas disponibles y se sospecha que el virus se ha puesto resistente al ganciclovir. También se puede poner resistente a foscarnet. Se han desarrollado dos tipos de ensayos para determinar la susceptibilidad a los antivirales de uso habitual. Los dos ensayos que están actualmente en uso no se realizan en Chile. Uno es el ensayo de reducción de placa, en el que se inocula un cultivo de tejido y se observa la reducción de los focos de efecto citopático, en presencia de ganciclovir o foscarnet, comparando con un control. El otro es un ensayo de hibridización de DNA, que es prácticamente lo mismo. Se observa la disminución de la señal de hibridización del DNA en presencia de un antiviral. Estas técnicas exigen aislamiento y pasaje en cultivo del virus, por lo que demoran de cuatro a seis semanas. Ambas miden resistencia fenotípica, es decir, más o menos la realidad que se observa clínicamente en el paciente.

Como se conocen bastante bien las mutaciones que debe sufrir el CMV para desarrollar resistencia, como las dos mutaciones que dan la resistencia al ganciclovir, ellas se podrían detectar genómicamente. No se conoce bien la correlación con el fenotipo y, como es un virus muy variable, podrían coexistir distintas poblaciones en un mismo paciente. En un momento podría estar predominando una sensible y, bajo ella, poblaciones resistentes no detectadas genómicamente. Sobre esto hay investigación en curso.

Desde el punto de vista clínico, lo más fácil es detectar la carga viral o la antigenemia, y observar si no hay una reducción del virus o de su replicación con el uso de antiviral. Las consecuencias clínicas de la resistencia al ganciclovir no están muy bien establecidas. En los pacientes con infección invasora tratados con ganciclovir hay una prevalencia de resistencia de 10-20%, con persistencia de aislamiento viral positivo. La evolución del CMV es consecuencia de muchos factores, no sólo de la aparición de resistencia. Esta es una limitación al uso de la carga viral como método para detectar resistencia. La alternativa de manejo, en este minuto, es el foscarnet.

Para terminar, estas son las herramientas terapéuticas disponibles: ganciclovir, foscarnet, zidofovir, el cual, actualmente, se ha utilizado más como implante ocular para controlar la retinitis, y la gamaglobulina hiperinmune.

Con el tratamiento del CMV en inmunodeficientes surgió el concepto de un nuevo tipo de tratamiento, en gran parte gracias al desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico. Existe el uso terapéutico de antivirales, que es bastante común, pero está también el uso profiláctico de algunos de estos antivirales, y otro nuevo tipo de tratamiento, el tratamiento presuntivo, que es el que se inicia cuando se detecta la presencia del virus en un individuo y se presume que, si no se lo trata, va a presentar la enfermedad. En ese sentido, para el tratamiento presuntivo, es fundamental la confiabilidad de nuestras medidas de diagnóstico y el valor pronóstico que tengan.

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