Resumen

Me voy a referir a algunos aspectos de tipificación epidemiológica aplicados a las infecciones nosocomiales. En la Clínica Mayo hemos evaluado varios métodos de tipificación, porque hacemos estudios no sólo para la clínica sino para clientes en todo el mundo. Nos abocamos principalmente al Staphylococcus aureus meticilino resistente (SAMR) y Enterococcus resistente a vancomicina (VRE), aunque hacemos también otros, incluso algunos gramnegativos.

La literatura está llena de todo tipo de métodos de tipificación, algunos muy elegantes, pero muy complicados y difíciles de entender. Nosotros usamos la electroforesis de campo en gel, desde hace diez años, y continuamos usándola, ya explicaré por qué. La experiencia que voy a mostrar al respecto no es una infección nosocomial sino un brote epidémico en la comunidad, en el cual usamos varios métodos para definir el brote.

Si observamos una fotografía de policías ingleses, creo que durante la epidemia de gripe de 1918, lo primero que se piensa es que son todos iguales, pero, si nos fijamos, veremos que son distintos, tienen distinta altura y diferentes sombreros. Son todos Homo sapiens, pero diferentes cepas. Cuando hablamos de bacterias, los infectólogos necesitan saber si las bacterias son diferentes o no. Esto se puede determinar tanto fenotípica como genotípicamente. Los fenotipos se usaron durante bastante tiempo. Después aparecieron los biotipos, que son de alguna utilidad y que aún se usan en muchas partes. Por ejemplo, si en una unidad se sospecha un brote, no digamos por SAMR, sino un E. coli resistente, al analizar los antibiogramas se verá si hay distintos fenotipos y eso dará una idea acerca de si todas las bacterias son de la misma cepa o no. Incluso hoy en día este método permite tener una idea sobre si los microorganismos aislados pudieran tener origen clonal.

La serotipificación se ha usado durante muchos años. Por ejemplo los tipos M y T del estreptococo grupo A han sido útiles para definir brotes de ellos en distintas unidades. También existe la fagotipificación, que son virus que infectan bacterias, que se usa primeramente para los estafilococos, y los tests bactericidas, que se han usado en Europa; personalmente, no los he hecho nunca. Se basa en que algunas bacterias producen toxinas que pueden matar otras bacterias y ciertos clones pueden ser susceptibles a ciertas bactericidinas o toxinas bacterianas, como la que producen las Pseudomonas.

Abordaré brevemente la biotipificación. El fenotipo se puede estudiar por análisis bioquímico y por susceptibilidad microbiológica, que son los métodos más usados. Como podrán imaginar, carece de especificidad y reproducibilidad, y además se limita a ciertos microorganismos, fundamentalmente, aquellos cuyo antibiograma incluye un panel grande de antimicrobianos. Muchos estarán familiarizados con la identificación bioquímica estándar de los microorganismos. Es la técnica con la que me formé, y aún la sigo usando. Por ejemplo, está el patrón de las reacciones a azúcares, típico de la E. Coli. Un biotipo que es muy útil es, por ejemplo, que la variedad El Tor de V. cholerae es hemolítica, mientras la mayoría de las otras no lo son. Se puede tener una idea de la presencia de la variedad El Tor por medio de una placa de agar, lo que corresponde, de hecho, a una evaluación fenotípica.

La serotipificación se ha utilizado durante muchos años. Ocurre cierta reactividad cruzada. Hay antígenos que se usan más corrientemente y que pueden tener reacciones cruzadas. Por ejemplo, en los días de la serotipificación del H. influenzae, que ya no se ve en los Estados Unidos desde que se usa la vacuna, se veía que presenta una reactividad cruzada con algunas variedades de E. coli, lo que significaba un problema. Otro problema que suele presentarse es con el neumococo y también con el SBHGA. Puede variar la expresión de material capsular, donde se encuentran los antígenos. Estos pueden no expresarse o no aparecer durante la técnica en el laboratorio, lo que produce falsos negativos.

Esta técnica es de alta exigencia para el laboratorio. Se necesitan conejos u otros roedores que produzcan los anticuerpos. Son pocos los lugares donde esto se hace. De hecho, nosotros derivamos nuestra serotipificación de estreptococos y neumococos a Edmonton, Canadá. Lo hacen también en el Reino Unido y en Minneapolis, pero los centros que lo realizan son realmente muy escasos.

Para los microbiólogos presentes, se muestra el ELAC test, que en realidad busca la toxina del Corynebacterium diphteriae, pero lo que me interesa es el principio. Se pone un papel filtro con anticuerpo antitoxina en la placa, el anticuerpo se difunde y, si el organismo produce toxina, se produce la banda de precipitación. Es en realidad el procedimiento de Ouchtelony, que es muy usado como una prueba serológica. Se puede hacer para exotoxina estreptocócica, pero hay que extraerla.

La fagotipificación era lo máximo cuando yo estaba recién estudiando infectología. Era un estudio limitado a estafilococos. Se necesitaba una biblioteca de fagos y, como lo que se observa es la lisis del estafilococo, sucedía que no todos se lisaban o no se disponía precisamente del fago indispensable. Sin embargo, fue útil en su tiempo.

Sobre los test bactericidas no puedo decir mucho, porque nunca los he hecho, pero son técnicamente complejos, se necesita tener las toxinas y están limitados a sólo ciertas especies de microorganismos.

Métodos genotípicos
Han tenido una verdadera explosión en los últimos diez años con el advenimiento de la tecnología molecular. Me voy a referir fundamentalmente a bacterias, ya que son las responsables de la mayor parte de las infecciones nosocomiales.

Se puede buscar DNA genómico, DNA de plasmidios y también RNA ribosomal, ya que en el genoma de las bacterias hay normalmente muchas copias de RNA ribosomal, es como una amplificación natural. Para trabajar con plasmidios, se necesita que la bacteria tenga plasmidios. Si no los tiene, estamos en problemas. Si hay plasmidios, se puede restringir ese DNA, cortarlo en piezas más pequeñas para buscar genes en especial. Está básicamente limitado a especies de estafilococos.

En la estructura de la molécula de DNA, hay que recordar los enlaces glicosídicos en la periferia y los puentes de hidrógeno al medio, los que se rompen fácilmente con el calor. Este es el principio de la PCR, separar el DNA por medio del calor. Las endonucleasas de restricción son enzimas que se aíslan de bacterias y rompen los enlaces glicosídicos. Nos sirven para fracturar el DNA y buscar ciertos patrones que pueden estar relacionados clonalmente con ciertos microorganismos. En 1988, para evitar la crisis de la edad media de la vida, hice un par de becas y una fue en Toronto, con Don Lowe. Buscábamos clones en la UCI y para ello usábamos enzimas de restricción que cortan bases con una cierta frecuencia, como la ECO-1. Se obtenían múltiples bandas del DNA genómico y ustedes podrán imaginarse el problema que teníamos para determinar si uno de esos verdaderos códigos de barras se parecía a otro. En esa época era aún muy difícil, pero era un gran adelanto. Esta técnica tiene muchas aplicaciones frente a diversos microorganismos. En aquellos años, nuestro problema era cómo sacar el DNA y los gramnegativos presentaban menos complicaciones para eso que los grampositivos. La dificultad era la interpretación de los patrones. Desde entonces la idea ha sido desarrollar métodos moleculares que generen pocas bandas, para tener una discriminación más fácil de las diferentes variantes.

En la literatura hay una gran cantidad de estas técnicas. Hemos analizado varias de ellas. Una es la ribotipificación, la que se basa en que los genes presentes en el DNA ribosomal tienen muchas copias en la mayoría de las bacterias. Se puede hacer crecer la bacteria, restringir los genes de RNA, amplificar, cortar con endonucleasas de restricción y observar los patrones. Muchas de estas secuencias son altamente conservadas y esto se detecta con enzimas de restricción. Otros métodos son la ribotipificación-PCR, de los cuales hay dos técnicas en las cuales tenemos experiencia: el 16s y el 23s son genes ribosomales estructurales. Entre estos genes hay lo que se llama espaciadores o pseudogenes, donde no se conoce función, pero hay ciert a cantidad variable de nucleótidos. En diferentes clones, la distancia entre los dos genes es diferente. Se amplifica a cada lado de estas regiones internas y se puede determinar con bastante precisión especies diferentes, ya que las distancias no son similares. Hay otro análisis llamado de restricción de DNA ribosomal amplificado, en el cual, básicamente, se amplifica el DNA ribosomal y se usan enzimas de restricción para cortarlo.

La electroforesis de pulsos en gel es lo que usamos nosotros y la mayoría de los grupos de todo el mundo usamos: se cultiva el microorganismo, se observa el genoma entero y se usan enzimas de restricción que cortan el DNA en trozos grandes (las llamadas endonucleasas de segmento grande), se hace la PCR y la electroforesis. Diferentes clones van a tener diferentes bandas. La razón de que esto sea así es que se usan condiciones de baja exigencia, es decir, se hace la PCR de manera que hay hibridización, aunque no haya total complementación del primer con el DNA objetivo; puede haber un grado de mismatch. Esta baja exigencia permite la amplificación de DNA de distintas especies. Una variante de este método se llama RAPID (Random Amplified Polimorphism Detection). Usa primers más pequeños, pero el mismo principio de la técnica.

Muchos de ustedes deben conocer el fingerprinting del M.tuberculosis. Lo que ocurre con las Mycobacterias es que tienen secuencias de inserción. Son partes del DNA que contienen su propia maquinaria de replicación e inserción, tienen sus propios genes que codifican para ello; son, entonces, genes "saltadores" que "saltan" en el genoma. El M. tuberculosis contiene 10-20 copias de ellas y distintos clones tienen distintas secuencias de inserción. Difieren en el área y el número total de secuencias de inserción. Lo que se hace es amplificarlas en Mycobacterias cultivadas, y luego usarlas como sondas. Este es el estándar para determinar clones de M. tuberculosis. Otra técnica, que probablemente han visto en la literatura, es la amplificación de polimorfismo de largo de fragmentos. Básicamente se hacen crecer los microorganismos, se obtiene todo el DNA genómico, se rompe con enzimas de restricción y el kit permite unir esos fragmentos de DNA a ambos lados de los sitios de restricción. Este DNA restringido se amplifica y se obtiene un patrón que es único para ese microorganismo. Probamos esta técnica y lo bueno es que es automatizada y se puede hacer en un secuenciador de DNA. Creo que esto indica que vamos hacia la automatización de los procesos de fingerprinting y genotipificación.

Otro método que hacemos y que se utiliza bastante, en general, es que muchos genes presentes en los microorganismos tienen secuencias hipervariables en su extremo amino terminal. Gracias a esas partes hipervariables se puede secuenciar el extremo N-terminal del gen y, a partir de esta información de secuencia, clasificar los microorganismos. Lo hemos hecho e incluso lo hemos publicado. Publicamos un estudio con el gen de la proteína A del estafilococo hecho con este enfoque.

Todos estos métodos y algunos otros son buenos, pero el más usado es la electroforesis en campo de pulsos en gel (PFE). Es, al menos en los Estados Unidos y creo que en todo el mundo, el estándar para la tipificación de cepas de bacterias. Esto se debe, en parte, porque es relativamente fácil de hacer, no es tan simple, y porque hay criterios para interpretar los resultados, al contrario de todos los otros métodos, en los que no existen criterios. Los criterios de interpretación fueron formulados por un panel de consenso. Se podría discutir acerca de la confiabilidad del panel, pero ellos son los “brujos sabios” y decidieron cuándo un patrón determina clonalidad. Como los fragmentos de restricción del DNA son muy grandes, para introducirlos y hacerlos correr en gel, hay que "bombearlos" hacia adentro, doblarlos y empujarlos, lo que se hace alternando corriente a través del campo de gel durante 10 a 24 horas. Es demoroso empujar esos enormes pedazos de DNA a través del gel. La razón de esos fragmentos enormes de DNA es que se usan enzimas de restricción que necesitan una secuencia de seis bases antes de hacer el corte. Existen otras enzimas de restricción que cortan al reconocer cuatro bases. La diferencia de tamaño de los fragmentos con ambas enzimas es muy significativa.

Como recordarán, ya comenté lo difíciles de leer que resultan los geles con fragmentos de restricción de DNA muy pequeños. Un ejemplo que lo explica es el estudio de un brote de SAMR en una UCI neonatal, utilizando técnicas con fragmentos de restricción grandes y pequeños. Con los patrones de fragmentos grandes, más fáciles de leer e identificar, se pudo establecer, comparando los gérmenes aislados de los diferentes recién nacidos, que existían varios clones de SAMR, ya que, como señalé, hay criterios para esto. Con el uso de fragmentos de restricción más pequeños se pueden detectar mutaciones en el tiempo. Por ejemplo, en un patrón de cinco bandas con los fragmentos grandes, si ocurre una mutación, se van a producir, dentro del DNA presente en las bandas, nuevos sitios de restricción que las enzimas de fragmentos pequeños van a reconocer. Por ejemplo, una banda puede aparecer dividida en dos, o bien dos bandas fusionarse en una. También puede cambiar la movilidad de una banda, ya que, si se produce una inserción, el tamaño del fragmento de restricción va a aumentar, mientras que si se produce una eliminación, va a disminuir y la movilidad será diferente. Así, podemos determinar con mucha exactitud cuáles son y qué ha pasado con estas cepas. La referencia es un panel sobre microorganismos, respaldado por el CDC, quien también entrega los criterios de interpretación. Estos, a veces, pueden ser algo complicados de entender, como le hemos planteado al consultor del CDC que nos apoya. Lo que hacemos al informar los resultados es básicamente lo siguiente: si los patrones de bandas son iguales, se dice que es un clon; la situación más habitual en un brote. Si hay una o dos bandas diferentes, se dice que hay similitud, pero que no son distinguibles claramente dos clones. Si hay tres o más bandas diferentes se informa que son distintos. Se deja al equipo de control de infecciones decidir si los microorganismos están o no relacionados. En nuestra institución, las enfermeras de control de infecciones están tan adiestradas que, muchas veces, al recibir este tipo de informe y mirar el patrón, la enfermera suele decir: “Creo que es el mismo clon que ha evolucionado en el tiempo y ha ganado o perdido sitios de restricción”.

Un ejemplo de la aplicación de esta tecnología es el estudio de un brote de infecciones invasivas por estreptococo grupo A en el sur de Minnesota, publicado en el JAMA hace algunos años. Entre enero y febrero de 1995 hubo dos casos de enfermedad estreptocócica invasiva. El primer paciente hizo un síndrome de shock tóxico y murió. Es poco frecuente ver dos casos similares ocurrir tan próximos uno del otro. Es interesante que los tecnólogos del laboratorio, por su análisis fenotípico, sugirieron una posible clonalidad, porque los microorganismos tenían apariencia mucoide, por tener cápsulas muy gruesas. Nos entusiasmó la posibilidad de estudiar un brote y decidimos utilizar muchos. En cerca de dos meses terminamos el estudio de todos los casos. El patrón a la electroforesis de pulsos en gel resultó ser muy característico de uno de nuestros clones de referencia. Al verlo, supimos de inmediato que probablemente era nuestro clon que se había diseminado en la comunidad y decidimos estudiarlo exhaustivamente. El mismo clon apareció un poco antes, en otoño, en Carolina del Norte, afirmando la idea de que se estaba extendiendo. Se hizo el análisis del extremo amino terminal del gen EMM, que codifica la proteína M, la que se utiliza en serotipificación. Por investigaciones previas, realizadas con el grupo de Baylor, sabíamos que el extremo N terminal de este gen tiene gran variabilidad, por lo que lo aplicamos en este caso. Usamos además otros métodos de tipificación, como sondas internas para genes SPE, de la exotoxina pirogénica, la tipificación fenotípica, las proteínas SPE por Ouchterlony y la serología para proteínas M y T, que se enviaron a Edmonton. Con todos estos análisis de las cepas, en poco tiempo se pudo definir muy bien que había sido realmente un brote por el clon PGF-1. Ocho entre 15 cepas aisladas durante este brote tuvieron el mismo patrón con la electroforesis de pulsos en gel, haciendo interesante notar que había también otras cepas de SBHGA circulando en la región al mismo tiempo correspondientes a clones diferentes. Descubrimos que siete de estos ocho casos eran de tres condados adyacentes y tres provenían de Wannamingo, un poblado en Minnesota, cuya población disminuyó de 878 a 876 habitantes en un par de días. Fue una tasa de ataque alta, de 342 en 100.000, en partes geográficamente distantes, por lo que se interesó el CDC. La conclusión es que este brote de una nueva variante de SBHGA no se habría determinado sin la electroforesis de pulsos en gel.

Analizando las características de los pacientes según su patrón electroforético, aunque no había diferencias demográficas notables, los ocho casos con el PGF-1 hicieron un cuadro más grave, con síndrome de shock tóxico en 63% y una mortalidad considerable, a diferencia de los casos infectados por los otros clones, entre los cuales sólo uno hizo la complicación.

Un comentario sobre el estudio fenotípico: la mortalidad se relacionaba con la presencia de una proteína SPE (es la exotoxina pirogénica asociada con el síndrome de shock tóxico).
Se decidió, entonces, en conjunto con el Departamento de Salud de Minnesota, analizar los cultivos faríngeos de rutina, que en Rochester se realizan en todos los casos de faringitis, para documentar el estreptococo grupo A. Se estudiaron con electroforesis de pulsos en gel y se descubrió una alta tasa de clon PGF-1. Se decidió evaluar hasta dónde se había esparcido el brote, por lo que se estudiaron los niños con faringitis en las escuelas de diversas localidades, a diferentes distancias del sitio del brote. La tasa de infección por PGF-1 era baja, de 1% en general, pero en Wannamingo era de 78% y 10% en las zonas cercanas. Se estudió entonces la portación en ese poblado, tomando cultivos faríngeos a niños asintomáticos, sin faringitis, y se encontró que la cepa PGF-1 era muy frecuente en chicos que eran asintomáticos, pero que estaban colonizados. Fuimos a Wannamingo, un pueblo muy pequeño, cuya escuela no tenía calefacción, y resultaba demasiado caro edificar una escuela nueva con mejores condiciones. En invierno, cerraban las ventanas, que también eran de un modelo muy antiguo. En invierno, ahí el frío es muy intenso. Dicho sea de paso, el brote fue en invierno. Especulamos que la densidad de bacterias era tan alta en la escuela por la falta de ventilación, al mantener las ventanas cerradas. De los casos fatales del brote, uno era conserje de la escuela; otro era un abuelo que iba cada día a buscar a sus nietos a la escuela; otro, chofer del bus de la escuela y el otro era un paciente nuestro, de Rochester, que queda a 30 millas de distancia, que también iba a buscar a sus nietos a la escuela. Todos ellos murieron de síndrome de shock tóxico. Consideramos, aunque en forma de especulación solamente, que el foco del brote era la escuela.

Seguimos el brote desde enero hasta junio. Hubo casos incluso después de los tres primeros meses del año, a pesar de que la mayoría se concentró en ellos. Me imagino que en Chile también sucede que en invierno es más frecuente la enfermedad estreptocócica. A medida que el brote progresaba en el tiempo, la electroforesis de pulsos en gel varió, indicando que el microorganismo mutó. Lo llamamos PGF-1.1 e identificamos el alelo mutado en la secuencia del gen EMM. A pesar de las diferencias en el patrón electroforético, los métodos de tipificación clásicos permanecieron sin variación. Esto sugiere que la electroforesis de pulsos en gel puede decir más acerca de la dinámica de un brote y de la evolución de una cepa, lo que la hace muy atractiva epidemiológicamente. En conclusión, gracias a la tipificación, determinamos que en Wannamingo había un clon M3 muy virulento, que causaba enfermedad invasiva grave, y mientras más alta era la frecuencia de M3 en las gargantas de la gente de Wannamimgo, mayor era la incidencia de enfermedad. Aunque es extremadamente lógico, antes nunca se había comunicado una situación así.

Decidimos estudiar la presencia del clon en el resto de los Estados Unidos, para establecer hasta dónde podía haberse extendido. En los meses siguientes recibimos muestras no sólo de los Estados Unidos sino de todo el mundo. El PGF-1 fue encontrado en Japón y Australia. La electroforesis de pulsos en gel fue muy concordante en todos los casos, con mínimas variaciones.

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