Resumen

Introducción

Se analizará este tema, con una aproximación más bien morfológica, en los siguientes aspectos: el hecho de que las cininas se producen y se modulan en el intersticio, las evidencias de que las alteraciones del sistema calicreína, ya sea de la enzima calicreína o de la enzima convertidora, contribuyen al avance de la enfermedad renal y, finalmente, cómo se ha demostrado que existe un desequilibrio entre ambas.

Sistemas vasoactivos calicreína-cinina, renina-angiotensina

Hace unos veinte años, Williams publicó en el N Engl J Med uno de los primeros trabajos acerca de los sistemas vasoactivos calicreína-cinina y renina-angiotensina, en el que se señalaba que cumplían funciones antagónicas en la regulación de la presión arterial. Posteriormente, en un trabajo de Carretero se demostró que las interacciones existentes eran muy complejas y que afectaban también el nivel cardiovascular.

Ambos sistemas intervienen en la arquitectura y remodelamiento, no sólo del sistema renal sino también del cardiovascular, con un efecto final antitrófico, natriurético y depresor. La angiotensina II tiene un mecanismo presor-trófico; cuando el receptor AT 1 se bloquea, actúa sobre el AT 2 y aumenta las cininas, lo que tiene un efecto benéfico. Sin embargo, estudios recientes de Jesús Egido demuestran que NF-kappa B, uno de los principales factores de transcripción de la inflamación, se activa por acción de los receptores AT I y AT II, por lo que lo anterior no es del todo correcto.

Estos sistemas se encuentran en muchos tejidos y hay que estudiarlos en términos paracrinos, es decir, es necesario ubicar las células en las que se sintetizan estas sustancias y los receptores en los que actúan, que deben estar en sitios cercanos. Desde esta perspectiva, los niveles hormonales circulantes tienen poca importancia; lo importante es dónde se producen. Por este motivo, se estudia primero la morfología y la localización, y luego se realizan los modelos de función.

Localización de los sistemas
Los componentes del sistema calicreína están en el túbulo conector; el cininógeno se encuentra en el túbulo colector y en la circulación general, la cinina A2 o enzima convertidora está en las células endoteliales del túbulo proximal, el receptor de bradicininas B2, en el túbulo colector, y sus mediadores ciclooxigenasa 1 (Cox-1) y ciclooxigenasa 2 (Cox-2), en el túbulo colector y en el asa ascendente de Henle.

La calicreína está localizada sólo en un tipo celular, de los treinta que tiene el riñón, en el túbulo conector.

Esta observación, realizada en riñones humanos y de ratas, llevó a postular que existe una interacción entre ambos sistemas, por lo menos en la hemodinámica glomerular. A lo largo del nefrón está la enzima convertidora, la calicreína, el cininógeno y el receptor. Jorge Rodríguez ha identificado la Cox-2 en el asa ascendente gruesa, en el que sostiene que es un nuevo tipo celular del nefrón.

En cuanto a ultraestructura celular, la primera foto de localización de la calicreína se obtuvo en un trabajo realizado junto a Carlos Figueroa hace varios años. Es una enzima que se libera a la orina, pero además está presente en el retículo endoplasmático rugoso de Golgi, en vesículas secretoras que van hacia el lumen y al lado basal. En esa oportunidad se postuló que la calicreína podría pasar al lado basal y, por lo tanto, al intersticio, donde podría generar cinina.

Años después, otros investigadores transfectaron con el gen de calicreína unas células MDCK del túbulo distal, in vitro, y observaron que la calicreína de estas células pasaba en razón 4:1 entre el lado urinario y el basal, confirmando la hipótesis planteada originalmente. El paso de calicreína hacia el lado basal significa que tiene la capacidad de generar cininas, bradicinina y de pasar a la circulación sanguínea.

Las cininas se generan en el intersticio renal. En un trabajo de Siragy y Carey, publicado en 2001 en Hipertensión, se demostró que se puede medir en vivo la cantidad de bradicinina generada en distintas condiciones mediante técnicas de microdiálisis, que utilizan pequeños tubos de diálisis insertos en el intersticio renal. El GMP es un mediador del óxido nítrico, que a su vez es el mediador de la bradicinina; en ratas con dieta normosódica e hiposódica aumenta la cantidad de cininas generadas en el intersticio renal. Si se utiliza un inhibidor de la enzima convertidora, aumenta aún más la cantidad de bradicinina; si se administra un antagonista del receptor de angiotensina tipo 1, también aumenta, y el efecto de ambos es sumatorio.

Estos incrementos se revierten casi completamente con antagonistas del receptor tipo 2 de angiotensina II, lo que indica que parte del aumento de la bradicinina en el intersticio se debe al efecto sobre el receptor AT 2. Las cininas en el intersticio renal están reguladas y cambian en varios órdenes, de 10 a 50 ó 70 nanogramos o picogramos/minuto.

Un estudio del grupo de Jean-Pierre Girolami, publicado en el Journal of Clinical Investigation, demuestra que la bradicinina reduce la fibrosis renal. El grupo usó el modelo clásico de obstrucción ureteral unilateral, en el cual se sabe que la fibrosis se atenúa al utilizar inhibidores de la enzima convertidora, y observaron que en ratones sin receptor de bradicinina o con bloqueo de éste con un antagonista específico, la fibrosis intersticial aumentaba; en cambio, al sobreexpresar la enzima calicreína se reducía tanto la fibrosis como los activadores del plasminógeno y metaloproteinasas, lo que indica que el efecto de la bradicinina es protector frente a la degradación de la matriz extracelular.

Prince demostró lo mismo en fibroblastos cardíacos, en 1995, y describió que la bradicinina en cultivos reducía la producción de colágeno I-III en fibroblastos, efecto mediado por prostaciclina.

Función renoprotectora del sistema calicreína
Se han acumulado evidencias en apoyo de la hipótesis de que el sistema calicreína es renoprotector cuando está indemne. Por ejemplo, las ratas con bajos niveles de calicreína presentan hipertensión sensible a sal; de hecho, se puede clasificar a los seres humanos sensibles a la sal según su nivel de calicreína. Por otra parte, si se transfecta el gen de calicreína a las ratas Dahl, que son sensibles a la sal, se revierte el daño en este modelo.

La administración del gen de calicreína protege del daño por gentamicina en ratas. Al separar las ratas por fenotipo, las que presentan menor excreción de calicreína son más susceptibles al daño por gentamicina, según datos que se encuentran en vías de publicación.

El modelo de selección de ratas según fenotipo ha sido bastante útil para el estudio de este tema. Se seleccionaron miles de ratas que excretaban poca calicreína y se cruzaron entre ellas, sin intervención genética. Están las ratas normales (Wistar normal) y las ratas con calicreína baja; si a éstas se les suministra una dieta alta en sodio, se vuelven hipertensas; si se administra gentamicina en igual dosis a ambos grupos, las que presentan calicreína baja muestran mayor daño renal; es decir, la deficiencia de calicreína favorece un mayor daño renal. Este trabajo se publicó el año pasado en Kidney International, en colaboración con Paolo Madeddu.

Otros experimentos transgénicos con administración de calicreína reducen la hipertrofia ventricular y aumentan la función renal en ratas Goldblatt. En la diabetes experimental también hay disminución de la síntesis y de la regulación de calicreína, según datos que se publicaron en 1997.

Estudios de este año, publicados en Circulation, demuestran que al transfectar estos animales con el gen de calicreína se puede impedir la microangiopatía y parte del daño renal. Otro modelo experimental, descrito en un trabajo de Sofía Salas, señala que al existir inhibición del óxido nítrico se observa daño renal y disminución de calicreína.

En general, en los modelos de daño renal hay disminución de calicreína y aumento de la enzima convertidora. No postulamos que esto sea patogénico, lo que nos preocupa es el avance del daño. Al establecerse cierto daño renal, se genera un círculo vicioso, con menor producción de vasodilatadores, mayor producción de vasoconstrictores y profibróticos.

Se sabe que la alteración del sistema calicreína produce hipertensión sensible a la sal, inducción local de enzima convertidora, como mecanismo patogénico en la nefritis de túbulo intersticial, y desequilibrio entre la enzima convertidora de angiotensina y calicreína.

Desequilibrio de los sistemas
Durante muchos años buscamos un desequilibrio entre estos dos sistemas correlacionando los niveles de renina con los de calicreína, pero con los niveles de calicreína asociados con daño renal, los niveles de renina eran normales. Por eso, postulamos que el desequilibrio se produce entre la calicreína y la enzima convertidora.

La enzima convertidora es una cininasa y es realmente el nexo entre los dos sistemas, ya que convierte la angiotensina I en II y degrada la bradicinina. La angiotensina I-7 es un producto del otro sistema, es un sustrato que inhibe la enzima convertidora y probablemente actúa como vasodilatador al interactuar con el receptor de bradicinina.

Existe una interacción cruzada entre la enzima convertidora y el receptor de bradicinina. Se ha demostrado que cuando la enzima convertidora está en la misma célula que el receptor de bradicinina, se inhibe la desensibilización del receptor y la internalización, de modo que al inhibir la enzima convertidora no sólo aparecen niveles mayores de bradicinina, sino que también el tejido responde más a ella. Esto tiene que ver con el extremo carboxi-terminal de la enzima.

Cinética de la enzima convertidora de angiotensina
Entre las propiedades cinéticas de la enzima convertidora, hay que destacar que la Km es 80 veces más alta para bradicinina que para angiotensina I. Esta constante, que señala afinidad (a menor Km, mayor afinidad), es 24 veces más alta, lo que indica mayor selectividad, con niveles de sustrato relativamente semejantes. Con esta diferencia en Km y constante catalítica, esta enzima no debería llamarse convertidora de angiotensina I, sino cininasa o bradicininasa, que además convierte la angiotensina I en angiotensina II.

La enzima tiene dos sitios activos en su estructura. La cola carboxi se encuentra a nivel intracelular y es específica del lugar de síntesis; la enzima circulante no la posee. Hemos usado anticuerpos contra esta cola, que identifica con exactitud el lugar donde la enzima convertidora se sintetiza. La inhibición de la enzima convertidora produce mucho más que un aumento de los niveles de bradicinina: aumenta la unión de bradicinina al receptor, bloquea la desensibilización, disminuye la internalización y potencia el efecto. Esto no sucede con la enzima convertidora soluble, sino sólo con la que está en la célula en donde se ubica el receptor de bradicinina.

La utilización de un anticuerpo contra el extremo carboxi intracelular evita la necesidad de detectar grandes cantidades de la enzima convertidora circulante y se puede ver la localización típica de la enzima convertidora, en el ribete en cepillo.

Posteriormente estudiamos la enzima convertidora de angiotensina en las ratas Goldblatt, que tienen la renina disminuida debido a que la angiotensina II está aumentada y a que hay hipertensión, pero la enzima convertidora está aumentada en las células endoteliales hipertróficas.

En el riñón hipertenso, la lesión túbulo intersticial es de consideración, con osteopontina, ED1, fibroblastos y colágeno III, es decir, hay un proceso inflamatorio. Hay un gran aumento de la enzima convertidora en el riñón, en comparación con el control. En general, la rata tiene menos enzima convertidora que el ser humano.

El aumento de la enzima convertidora ocurre en sitios específicos de fibrosis, identificados por tinción de picrocirio; aparece no sólo en el lumen sino además en el intersticio, en células que aún no están identificadas, pero que podrían ser macrófagos o miofibroblastos. En la región peritubular dañada, estas células aparecen expresando enzima convertidora. Al cuantificarlo, se ve claramente que en el túbulo intersticial de las ratas hipertensas hay un aumento de la enzima convertidora, lo que también ocurre en arterias y en los túbulos proximales; sin embargo, nunca la hemos detectado en el glomérulo.

En un trabajo realizado en colaboración con Richard Johnson y publicado el año pasado, comprobamos que, en el daño producido por hipokalemia y la sensibilidad a la sal que se induce, existe un aumento significativo de la enzima convertidora, tanto en células tubulares como en el intersticio, en relación con el control. Lo interesante es que, además, la calicreína está disminuida en los mismos tejidos, igual que los nitritos (derivados del óxido nítrico) y las prostaglandinas vasodilatadoras. Es decir, hay una disminución de todo el sistema vasodilatador.

En un modelo que describió Richard Johnson en 1999, tras una breve exposición a fenilefrina se induce daño renal leve y sensibilidad a la sal, que aparece incluso después de disminuir la infusión de la catecolamina. Las ratas tratadas con catecolaminas, con fenilefrina en este caso, presentan un gran aumento de la enzima convertidora, comparadas con las ratas tratadas con solución salina. En estos casos también está disminuida la calicreína.

Conclusiones

Proponemos que existe un desequilibrio entre la enzima convertidora y la calicreína, que aparece durante el inicio o el avance del daño renal. Desde el punto de vista del avance, esto no es demasiado relevante, porque una vez establecido es preciso tratarlo.

En las ratas Goldblatt, en la infusión con fenilefrina, en la hipokalemia y en la insuficiencia renal crónica, hemos identificado gran parte de los cambios que se producen.

En trabajos de Sharon Anderson y, recientemente, en un trabajo conjunto con Egido y Mezzano, hemos observado que en la nefropatía diabética está aumentada la enzima convertidora.

En resumen, este desequilibrio entre estas dos enzimas, que se puede modular con medios farmacológicos, produce el daño renal y contribuye a su avance, porque disminuye la bradicinina y aumenta la angiotensina II.

Hay otras enzimas y vías alternativas para producir angiotensina II, pero no hay una enzima tan potente para degradar bradicinina como la enzima convertidora o cininasa 2. Otras enzimas, como la endopeptidasa neutra, contribuyen a la degradación de la bradicinina, pero no con esas propiedades de afinidad bioquímica.

En resumen, la inducción de la enzima convertidora necesariamente se asocia con una mayor degradación de bradicinina y el desequilibrio entre estos dos sistemas puede contribuir tanto a la sensibilidad a la sal como a la fibrosis túbulo-intersticial.

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