Resumen

Introducción
En esta presentación se entregarán datos históricos y algunos de los conceptos que se desarrollaron, a partir del descubrimiento del óxido nítrico (NO), relacionados con el funcionamiento del sistema cardiovascular. En la próxima se mostrará lo que se está realizando respecto a la acción del óxido nítrico sobre la regulación de la respiración celular y cómo puede llegar a tener un papel fisiopatológico basado en su acción cardiovascular fisiológica.

Historia
Este campo de investigación se inició a partir del descubrimiento de la relajación dependiente del endotelio, descrita en 1980 por Furchgott, quien describió una sustancia que llamó factor relajante derivado del endotelio (EDRF o endothelium-derived relaxing factor), liberada por el endotelio vascular y transferida al músculo liso vascular con el mensaje de relajación (Nature 1980;288:373-6). En experiencias consideradas clásicas, demostró que, en un lecho vascular contraído con noradrenalina, la acetilcolina agregada al medio produce la relajación prevista, si el endotelio se preserva; en cambio, si al vaso se le retira el endotelio, la acetilcolina no produce relajación. Con el paso de los años, muchos laboratorios del mundo confirmaron la existencia de esta relajación dependiente del endotelio y también demostraron que, en situaciones fisiológicas, el EDRF tenía una vida media muy corta, de tres a cinco segundos.

En 1985, nuestro laboratorio se interesó en el EDRF. En vez de tiras y anillos vasculares, mediante cultivos celulares se obtuvo grandes cantidades de células endoteliales. Estas se colocaron en microportadores, los que luego se usaron como generadores de EDRF y se bioanalizó su efluente directamente sobre tiras vasculares sin endotelio, con el objeto de analizar la farmacología y la estructura química del EDRF. Usando la técnica de columnas de cromatografía, se obtuvieron grandes cantidades de células endoteliales y se usó el efluente para superperfundir tiras de aorta de conejo sin endotelio, que fueron distanciadas cuidadosamente de las células endoteliales, para lograr tiempos fijos entre ellas y el vaso efector (el primer tejido a un segundo de distancia, y tres segundos entre los tejidos siguientes). Se empleó este modelo porque se sabía que el EDRF era una molécula muy inestable y que producía relajación vascular al activar guanilatociclasa soluble.

Poco tiempo después, Furchgott propuso que el EDRF no era un producto de la lipoxigenasa, como se pensaba, ni un producto del citocromo p450, sino que podría estar relacionado con el NO. Entonces se realizó en nuestro laboratorio el siguiente experimento, que demostró que el EDRF liberado de las células del endotelio vascular y el NO se comportaban exactamente igual en estudios farmacológicos paralelos. Los tres tejidos ubicados debajo de las células endoteliales fueron calibrados con nitroglicerina para que se produjera la misma relajación en todos ellos. Luego se estimularon las células con bradicinina que liberó EDRF para que pudiera relajar el primer tejido, al igual que la nitroglicerina, efecto que desapareció en 3 a 3,5 segundos. Al usar posteriormente NO auténtico, para igualar la primera relajación, la sobrevida de este componente a través de la cascada fue muy similar o idéntica a la de los componentes endógenos. Estos análisis farmacológicos paralelos y muchos otros demostraron claramente que el EDRF y el NO eran la misma sustancia (Eur J Pharmacol 1987;14:445-51).

Sobre la base de estos experimentos, se tomó la decisión de medir directamente el NO liberado de las células endoteliales en cultivo, para lo cual se utilizó una técnica que se emplea en la industria automovilística para medir NO como contaminante derivado de la combustión de petróleo y que se basa en la reacción del NO con el ozono, la que produce una señal de quimioluminiscencia que se puede medir con facilidad. Este equipo industrial se modificó para aumentar su sensibilidad alrededor de 1.500 veces, con el fin de poder conectar las células endoteliales directamente a él y medir el NO a través de la quimioluminiscencia. Las señales de quimioluminiscencia obtenidas con concentraciones 3, 10, 30 y 100 nM de bradicinina lograron una liberación dependiente de la concentración de NO equivalentes a 0,07 a 0,67 nanomoles de NO.

Para estar absolutamente seguros de que las señales medidas correspondían a la actividad biológica, se midió al mismo tiempo el efecto del NO liberado en una tira de aorta de conejo. La relajación producida por el EDRF liberado por bradicinina, en concentraciones de 3, 10, 30 y 100 nM, fueron las mismas que produjeron estas señales de quimioluminiscencia y se pudieron igualar en el estudio biológico con las mismas masas de NO que igualan la reacción química. Esta fue la primera demostración de que las células del endotelio vascular liberan el NO en cantidades suficientes para explicar las acciones del EDRF. Estos experimentos se publicaron en 1987.

Un año después, se demostró que el NO se sintetiza a partir del aminoácido L-arginina. La espectrometría de masa permitió demostrar que el NO marcado con N15 proviene de la L-arginina. Para esto se conectaron las células del endotelio vascular directamente al espectrómetro y se infundieron dos tipos de arginina: una marcada con N15 en todos los nitrógenos de la molécula y otra marcada en los 2 nitrógenos del terminal guanina, pues desde el principio se sospechó que el NO se sintetizaba con estos nitrógenos. Se estimularon las células con bradicinina, en presencia de una infusión de cualquiera de las dos argininas, y en ambos casos se recuperó NO marcado con N15 en cantidades similares, por lo que se llegó a la conclusión de que el NO estaba formado por los nitrógenos de los terminales guanina (Biochem Biophys Res Commun 1988;153:1251-6).

La identificación del EDRF/NO por quimioluminiscencia y la identificación de la cascada metabólica para la síntesis del NO inició el desarrollo de un campo de investigación llamado “área de L-arginina - NO”, incluyendo a la enzima, que se llamó “NO sintasa”.

En esta vía metabólica se forma un intermediario inestable, llamado Nω-hidroxi-L-arginina y un producto final denominado NO, al mismo tiempo que se forma L-citrulina. La NO sintasa incorpora oxígeno molecular en dos puntos de la síntesis: primero en la formación de Nω-hidroxi-L-arginina, y después en la formación de L-citrulina.

Descubrimiento del inhibidor L-MMNA
Un descubrimiento importante fue la identificación de un inhibidor de esta cascada llamado L-MMNA (NG-monomethyl L-arginine), versión monometilada de la L-arginina que contiene un grupo metilo en uno de los terminales de guanina, lo que le confiere la capacidad de ser un inhibidor competitivo para la unión de arginina a la NO sintasa, en un punto previo y otro posterior a la formación de N-hidroxi-L-arginina.

Aun después del descubrimiento de muchos otros inhibidores, en los últimos años, el L-MMNA sigue siendo el instrumento farmacológico más importante y la principal herramienta para el estudio y comprensión del NO y de otros sistemas biológicos.

Enzimas que generan NO
La biología molecular de las enzimas que generan el NO es sumamente compleja, pues contienen un dominio oxigenado, cerca de los terminales amino de las moléculas, y un dominio reductor muy similar a la citocromo p450 reductasa, y además tienen sitios para la unión de distintos cofactores bioquímicos y para calmodulina. El mononucleótido de flavina (FMN), dinucleótido flavina adenina (FAD), dinucleótido nicotinamida adenina (NADPH) son todos cofactores y cerca del terminal amino de las moléculas existe un sitio del ligando L-arginina, que es muy complejo y contiene tetrahidrobiopterina y un grupo HEME.

Las enzimas son muy similares, pues son homólogas en 95%, pero las codifican tres genes distintos. En los humanos, la sintasa de NO endotelial (eNOS) deriva del cromosoma 7, la enzima que participa en la síntesis de NO neuronal (nNOS), del sistema nervioso central y periférico, deriva del cromosoma 12 y el gen para el NO inducible (iNOS) por una sintasa codificada por el cromosoma 17. Estas tres enzimas sintetizan NO para funciones muy distintas y han originado el desarrollo de tres grandes campos de investigación.

La primera vez que se encontró que NO se libera constantemente en la vasculatura fue en experimentos con tiras vasculares, en los que se trataba de inhibir la relajación inducida por acetilcolina con un inhibidor de la NO sintetasa. En tejidos con endotelio, la L-NMMA bloqueó el efecto relajante de la acetilcolina, pero cuando se empezaron a examinar trazados en detalle se observó que cada vez que se utilizaba el inhibidor de la síntesis de NO, los tejidos se contraían en forma dependiente de concentración y endotelio, por lo que se supuso que seguramente el NO se generaba continuamente en estas tiras vasculares.

Luego se demostró, en preparaciones aisladas, que el L-MMNA era un vasoconstrictor muy potente de la circulación coronaria y este fue el punto de partida para experimentos en los cuales se inyectó L-MMNA, por vía endovenosa, a animales anestesiados y se obtuvo una respuesta hipertensiva muy significativa que se puede revertir con la administración de L-Arginina.

NO como regulador de la presión arterial
En 1989 se planteó que el NO era un regulador importante del flujo sanguíneo y de la presión arterial. Inicialmente, estos conceptos fueron muy difíciles de establecer. En un congreso de la Sociedad Británica de Hipertensión, una persona muy importante preguntó cómo era posible aumentar la presión arterial de estos animales sin afectar ninguno de los factores importantes que regulan la presión arterial, a lo que respondí que seguramente aún no se habían encontrado todos los factores que regulan la presión arterial. Este experimento fue importante, no sólo porque la L-MMNA produjo hipertensión arterial, sino por la forma en que la produjo, ya que esta hipertensión no se debió a un constrictor activo del músculo. La L-MMNA no tiene efecto sobre la musculatura lisa vascular sin endotelio sino que actúa retirando un tono vasodilatador significativo, tal vez el más significativo, presente fisiológicamente en el sistema vascular.

Estos experimentos se han repetido muchas veces de distintas maneras, pero la contribución más significativa a este concepto proviene de animales “knock-out”, que no expresan NO sintasa endotelial. Estos animales presentan un fenotipo hipertensivo y han tenido mucha importancia para entender las funciones fisiológicas del NO en el sistema cardiovascular y la forma en que la vasculatura responde a la injuria en ausencia de NO.

Efectos del NO
Se han desarrollado muchas hipótesis acerca del papel del NO, algunas de las cuales todavía se discuten y otras ya están establecidas. La primera ya se mencionó y se refiere a que, probablemente, el sistema cardiovascular está activamente dilatado por una liberación constante de NO. Esto se acepta ampliamente hoy en día, ya que, si se administra repentinamente un inhibidor de NOS, se observa un aumento de presión arterial o cierta vasoconstricción.

Un segundo aspecto, motivo de mucho debate, es que se ha planteado que la hipertensión puede desarrollarse en dos situaciones. En la primera, frente al control y a la regulación normal del diámetro de la pared vascular, donde las influencias sobre la vasoconstricción se ven antagonizadas y constantemente equilibradas por este tono NO dependiente, se produciría un verdadero aumento de las influencias vasoconstrictoras. En esta situación, seguramente, el vaso se defendería durante un largo tiempo, generando más NO que lo normal, lo que explicaría la vasoconstricción frente a la presencia de NO aumentado. En otra situación, existiría una verdadera disminución de la síntesis de NO y aquí lo más importante es que la actividad vasoconstrictora podría ser normal, pero la vasoconstricción podría estar aumentada debido a la falta del tono vasodilatador, el que es fundamental para regular esta situación desequilibrada. Es posible que existan dos situaciones productoras de una vasoconstricción aumentada: en una de ellas esto ocurriría como un mecanismo de defensa, frente al aumento del NO, y en la otra los estímulos para la vasoconstricción parecerían aumentados, pero en realidad no lo estarían, sino que existiría una ausencia del tono dilatador. En esta situación no hace falta invocar un aumento de los estímulos vasoconstrictores, en presencia de un inhibidor de la síntesis de NO, y se ha cometido el error de trabajar demasiado en este sentido, cuando en realidad, los estímulos vasoconstrictores normales, en ausencia de un tono vasodilatador, son suficientes para explicar el desequilibrio del sistema vascular, a favor de una vasoconstricción, y el aumento secundario de la presión arterial.

Además de su efecto vasodilatador, otros aspectos importantes que es necesario considerar son que el NO no es solamente un vasodilatador, sino que también es un inhibidor muy significativo de la agregación plaquetaria, tanto o más potente que la prostaciclina, y que en la regulación de la agregación plaquetaria ocurre una sinergia entre la prostaciclina y el NO. Por otra parte, el NO, de alguna manera poco clara, inhibe la proliferación celular del músculo liso de la pared vascular. Estas tres características del NO lo convierten en un regulador homeostático significativo de la biología de la pared vascular y permiten plantear que su ausencia podría tener un papel importante en condiciones como la hipertensión y la aterosclerosis.

En un artículo publicado en 1998 se describe un trabajo en ratones carentes del gen para NO sintasa endotelial, en el que se demuestra la respuesta de la pared vascular a la injuria. La respuesta proliferativa que se obtuvo en estas paredes vasculares fue mucho más alta en los animales que no generaban NO. Cosa interesante, se encontró una diferencia de sexo, ya que los machos tuvieron una proliferación mucho mayor que las hembras y éstas mostraron una ausencia completa de proliferación cuando estaban preñadas.

En resumen, el NO es muy importante en la regulación de algunos parámetros de la fisiología de la pared vascular y la comprensión de su mecanismo de acción va a ser muy importante para entender la respuesta a la injuria de dicha pared.

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