Resumen

Existen muchísimas citoquinas que regulan la reacción inflamatoria y la respuesta inmune. Algunas son proinflamatorias y otras antiinflamatorias. Para quienes se interesen por una revisión muy completa y actualizada sobre las citoquinas y sus receptores, hay una publicación reciente, Citokine Reference de Academic Press. También existe el sitio web de Citokine Reference. Con relación a lo que se va a presentar en esta exposición, también hay un sitio web de quimoquinas, en el cual se actualiza la información sobre la compleja nomenclatura de las quimoquinas y se puede obtener los datos más recientes sobre su biología.

Comenzaré con la definición de lo que se acepta actualmente como quimoquina:
Las quimoquinas son polipéptidos relacionados estructuralmente que tienen un papel crítico en el reclutamiento selectivo de subpoblaciones de leucocitos hacia sitios de inflamación, como un alotrasplante de órganos. También tienen participación en la migración y homing de leucocitos a los órganos linfoides secundarios, como los ganglios linfáticos y el bazo.

La clasificación de las quimoquinas se basa en la posición relativa de sus residuos cisteína amino terminales.

Las funciones reconocidas de estas citoquinas quimioatrayentes son el aumento de la expresión de moléculas de adhesión intercelular en las células endoteliales. También regulan la afinidad de esas moléculas de adhesión con sus respectivos ligandos. Promueven la movilidad dirigida o quimiotaxis de las células con receptores para ellas durante el proceso inflamatorio, gatillan la activación y proliferación de sus células blanco. Estas células pueden ser ciertos tipos de leucocitos o células endoteliales. .

Entre las múltiples y muy útiles reseñas recientes sobre estructura, función y biología de las quimoquinas, se destaca la más reciente, publicada por Murphy y Kransky en Immunity, 2001. Es una colección muy completa de reseñas sobre el tema. En uno de los números recientes de Pharmacological Reviews aparece también una reseña muy buena de la nomenclatura de los receptores de quimoquinas (International Union of Pharmacology. XXII. Nomenclature for chemokine receptors. Pharmacol Rev 2000; 52:145-76).

Uno de los problemas con que nos veremos enfrentados en esta exposición es la complejidad y la enorme cantidad de nombres y términos, probablemente miles, relacionados con las quimoquinas. En la actualidad, hay por lo menos 60 o 70 quimoquinas identificadas y se está caracterizando su inmunobiología funcional.

Podemos simplificar la diversidad estructural de la superfamilia de las quimoquinas en un diagrama, en el cual hay esencialmente cuatro familias de quimoquinas: las C, las CC, las CXC y las CX3C. La estructura de cada grupo se diferencia por la posición de los residuos cisteína en la parte amino terminal de las moléculas del grupo.

Los dos grupos más abundantes son las quimoquinas CC y las CXC. Las quimoquinas CXC se han subdividido últimamente en ELR(-) y ELR(+). ELR significa una secuencia de tres aminoácidos: glutámico, leucina y arginina. Las quimoquinas CXC ELR(+) poseen esta secuencia; en cambio, las ELR(-) carecen de ella.

Si bien en los grupos C, CC y CXC hay un número variable de quimoquinas en cada uno, en el grupo CX3C hay sólo una quimoquina conocida. Esta quimoquina particular está anclada a la superficie celular, en un dominio similar a la mucina y se la conoce con el nombre de “fractalquina”

Con los receptores de citoquinas es algo más fácil, ya que todos ellos están formados por siete dominios transmembrana, como un trozo de fideo que ondulara en la membrana. Una de las características de la biología de las quimoquinas es que un receptor en particular se puede unir con un número relativamente grande de quimoquinas y, por otro lado, una misma quimoquina se puede unir a varios receptores diferentes.

Como ya se dijo, hay un número considerable de citoquinas en cada grupo: se han identificado más de 25 quimoquinas CC, más de 15 CXC, dos del grupo C, y una única, la fractalquina, en el grupo CX3C. Los respectivos receptores se llaman CCR, CXCR, XCR y CX3CR .

Las cosas se complican más cuando tratamos de comprender esta diversidad de quimoquinas y receptores, en cuanto a la distribución biológica de los receptores, los que se expresan sobre una gran diversidad de leucocitos: macrófagos, linfocitos T activados, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células natural killer y cada receptor se puede unir a más de una quimoquina. Por ejemplo, el receptor CCR-1 se une a RANTES, MIP-1 alfa (proteína inflamatoria del macrófago-1-alfa), MCF–3 (factor quimiotáctico de macrófagos), MCF-4 y otras. Existen receptores que se unen a muchas quimoquinas, así como hay otros que se unen sólo a una o sólo a dos. A esto se debe que el cuadro completo sea extraordinariamente complejo y diversificado.

La interleuquina-8 fue la primera de las quimoquinas identificadas en el grupo CXC. También se une a más de un receptor. Se ha despertado gran interés, recientemente, por el efecto que pueda tener el bloqueo de ciertos receptores o de ciertas quimoquinas, en situaciones clínicas como la artritis reumatoídea o el alotrasplante de órganos.

En la literatura reciente hay publicaciones muy interesantes, respecto al efecto que tiene el bloqueo de un receptor en particular, el CXCR-3, por medio de un antagonista, o bien el bloqueo de la interacción por medio de un anticuerpo monoclonal dirigido contra una quimoquina en particular. Dado el inmenso número de quimoquinas y de receptores que se expresan en las reacciones inflamatorias e inmunológicas, es obvio preguntarse si el bloqueo de un solo receptor o de una determinada quimoquina tendrá algún efecto sobre el desarrollo del proceso, ya sea éste desencadenado por un proceso autoinmune o por el rechazo de un aloinjerto. Es notable que, de acuerdo a la literatura reciente, el bloqueo específico del receptor conduce a una prolongación significativa de la sobrevida del trasplante.

En el último tiempo, ha habido una verdadera explosión de informaciones nuevas sobre las quimoquinas y sus receptores. Los motivos de la demora en la comprensión de la biología de las quimoquinas son, por una parte, que hay un número muy limitado de anticuerpos monoclonales específicos para las quimoquinas de rata y ratón, y para sus receptores, que permitan disecar y entender los aspectos mecanísticos de la biología de las quimoquinas en modelos experimentales. Los anticuepos policlonales han sido de un valor muy limitado en este campo. Por otra parte, hasta hace muy poco, no se disponía fácilmente de ratones con nocáut genético específico. El uso de estos animales es reciente y ha permitido delimitar mejor ciertos aspectos de la biología de algunas quimoquinas y sus receptores.

Otro aspecto importante que ha obstaculizado una mejor comprensión es la diferencia entre los seres humanos y el ratón, en cuanto a las acciones de las quimoquinas, la expresión de los receptores y las interacciones entre ellos. Hay diferencias características en cuanto a la expresión y la función de ciertas quimoquinas, como la IL-8, y de receptores como el CCR-1 y CCR-4, entre animales y seres humanos, lo que hace difícil extrapolar a la clínica los hallazgos experimentales. Además, hay algunas quimoquinas en los roedores que no se han identificado en el hombre.

Voy a comenzar la relación de lo que se sabe actualmente respecto a quimoquinas y sus receptores, en el campo de los alotrasplantes de órganos, con un análisis de la injuria por isquemia- reperfusión.

Todavía hay pocos estudios sobre la expresión de quimoquinas en el primer período post trasplante. La cantidad limitada de trabajos publicados en los cuales se utiliza análisis RTPCR, orientados específicamente a la injuria por reperfusión en hígado y riñón, demuestra aumento de IL-8 y RANTES, respectivamente.

Las consideraciones futuras al respecto, para precisar las variaciones específicas de quimoquinas en estas situaciones, exigen mejores métodos de cuantificación, un análisis más amplio de quimoquinas y sus receptores, y un seguimiento más prolongado de la expresión de estas moléculas en el período perioperatorio del trasplante.

Con referencia al trasplante de riñón, específicamente, se han descrito dos quimoquinas expresadas en el epitelio tubular renal, en relación con la reacción de rechazo agudo: la MCP-1 y la MIP-beta (factor quimiotáctico de macrófagos –1 y proteína inflamatoria de macrófago-beta). Más información sobre estas dos quimoquinas, en particular en el rechazo agudo del trasplante renal, se publicó hace poco en Transplantation.La expresión de estas quimoquinas se correlaciona con la expresión del receptor correspondiente, el CCR-5, sobre las células T que infiltran el riñón rechazado. Se ha especulado que esto podría reflejar simplemente un daño tubular inespecífico, más que una lesión mediada inmunológicamente. Para aclarar esto se debe cambiar el análisis RTPCR por otros métodos, en particular por hibridización in situ y por métodos inmunohistoquímicos que permitan localizar con exactitud el sitio de expresión de las quimoquinas y receptores de interés. Esto permitirá una mejor comprensión de la relación entre la expresión de las quimoquinas y sus receptores en el tejido dañado y en las células que lo infiltran.

En lo que se refiere a alotrasplante de corazón, es interesante que en los corazones trasplantados funcionantes no se encuentra mRNA de quimoquinas, por RTPCR, ni expresión de la proteína. El rechazo, en cambio, se asocia con la producción de quimoquinas. Según lo publicado, hay expresión de RANTES por las células del infiltrado, que parecen ser células T de memoria y macrófagos. En alotrasplante humano se ha descrito que el número de células RANTES (+) se correlaciona con la intensidad del rechazo agudo. Algunos han postulado que el recuento de células RANTES (+) en biopsias de corazón trasplantado podría ser un análisis de laboratorio útil para el monitoreo inmunológico del trasplante.

Uno de los grandes problemas para analizar los resultados de los diferentes trabajos era la complejidad en la nomenclatura de las quimoquinas, cuyos nombres dependían sólo de lo que se sabía sobre su papel biológico. Para solucionar esto, se introdujo hace algunos años una nueva nomenclatura, de manera similar a lo que se hizo con las interleuquinas, con un sistema numérico. El objetivo es uniformar la manera de designar estas moléculas y evitar confusiones al recibir una de ellas diferentes nombres.

Mayores datos sobre la participación de quimoquinas en el rechazo de trasplantes, en ratas y en el hombre, aparecen publicados recientemente en Scandinavian Journal of Immunology y en American Journal of Kidney Diseases.

Sólo pretendo destacar la evidente diferencia en la expresión del grupo de quimoquinas CC, entre los riñones no rechazados y los rechazados, y la expresión tardía de algunas de ellas, en particular la CXCL-10, que corresponde al MIG de los macrófagos y que se conocía como asociada al rechazo.

Comparando los trasplantes singeneicos en ratas y los trasplantes humanos no rechazados, hay una amplia variación en el espectro de quimoquinas expresadas. Por ejemplo, la CXCL-1 se expresa sólo en los riñones que son rechazados. Algunas quimoquinas se expresan tanto en los riñones aceptados como en los rechazados, por lo que, evidentemente, no distinguen entre esas dos situaciones.

La persistencia en la expresión de un grupo de quimoquinas determinado parece correlacionarse con el rechazo. A la inversa, se ha descrito la persistencia de un determinado grupo de quimoquinas en injertos cardíacos de ratón aceptados por tiempo prolongado. Estos resultados provienen de los estudios de Robert Fairchild, uno de los pioneros en el estudio de quimoquinas y sus receptores en el trasplante experimental de órganos. Lo interesante en sus resultados es que la aceptación prolongada de un trasplante no depende de una ausencia de expresión de quimoquinas. Algunas de ellas se expresan siempre. Sin embargo, algunas, como la CCL-2 y la CXCL-9 no se expresan en el injerto cardíaco aceptado por tiempo prolongado.

El perfil de quimoquinas varía según el tipo de trasplante experimental. Algunas se observan solamente en trasplante de piel, otras aparecen sólo en el trasplante cardíaco. Hay quimoquinas que se expresan en el trasplante cardíaco alo o singeneico en el ratón, pero que no se encuentran nunca en trasplantes de piel entre las mismas cepas de ratones y viceversa.

El cuadro es complejo y de evolución rápida. Estamos comenzando a entender la cinética de la expresión de diferentes quimoquinas y su relación con la evolución del trasplante.

Una de las vías que ha recibido más atención es la vía IP-10-MIG-CXCR-3. IP-10 y MIG son ligandos conocidos del receptor CXCR-3. Estas quimoquinas recibieron otro nombre en la nueva nomenclatura. En lo que se ha publicado recientemente, es interesante que la expresión de IP-10 y de MIG intra trasplante es gamma-interferón dependiente. El receptor conocido para estas quimoquinas se expresa sobre células T activadas y sobre células NK en los aloinjertos experimentales. También es interesante que anticuerpos policlonales contra MIG prolongan notablemente la sobrevida de injertos de piel experimentales; así lo demuestran los trabajos de Fairchild, en que el anticuerpo de conejo anti MIG de ratón prolonga la sobrevida de un aloinjerto de piel, desde dos semanas hasta más de sesenta días. Se trata de un injerto de piel completa contra barrera MHC. El anticuerpo se administró día por medio hasta el día 21 post trasplante. Se observa claramente la diferencia en la cantidad de infiltado inflamatorio entre la piel trasplantada de los animales tratados y los controles inoculados con suero de conejo normal. Es un trabajo realmente importante, porque, a pesar de la tremenda variedad de quimoquinas y receptores expresados en el trasplante experimental, un anticuerpo dirigido contra una quimoquina en particular, en este caso el MIG, es capaz de prolongar en forma importante la sobrevida de un injerto de piel. Esto crea expectativas respecto a que el bloqueo de ciertas quimoquinas específicas podría ser un enfoque nuevo para el tratamiento del rechazo.

Otra publicación reciente, de Robinson y cols, en Journal of Immunology, demuestra que un anticuerpo contra fractalquina, conocida actualmente como CXC3CL-1, prolonga la sobrevida del aloinjerto cardíaco en ratón. Hay, por lo tanto, más de un ejemplo en el cual el bloqueo de una sola quimoquina, en ausencia de toda otra medida de inmunosupresión, es capaz de prolongar notablemente la sobrevida de los trasplantes en modelos experimentales.

El próximo punto por analizar es, entonces, si el bloqueo de quimoquinas o de sus receptores tiene algún significado práctico para el tratamiento en el trasplante de órganos. En ratones, el rechazo de un trasplante cardíaco incompatible, por sistema mayor de histocompatibilidad, se acompaña de la expresión de los cuatro grupos de quimoquinas y de la acumulación de células inflamatorias mononucleares que expresan los receptores correspondientes a éstas. Está claro que hay una base racional para este abordaje de la terapia del rechazo.

Un trabajo reciente, publicado en Journal of Clinical Investigation, realizado en ratones con nocáut génetico específico para el receptor CCR-1, demuestra que la ausencia de un receptor en particular para quimoquinas produce una prolongación en la sobrevida de los trasplantes y un aumento en la resistencia al rechazo crónico. Además, otros trabajos recientes muestran que los ratones con nocáut para CCR-2, CCR-5 o CXCR-3 también muestran una prolongación en la sobrevida de alotrasplantes cardíacos. Parece, por lo tanto, que el bloqueo, no sólo de algunas quimoquinas en particular sino también de ciertos receptores, puede ser una nueva forma prometedora de abordar el manejo del rechazo.

Muchas empresas farmacéuticas y de biotecnología trabajan activamente en el desarrollo de antagonistas sintéticos, con la esperanza de descubrir una droga capaz de bloquear la expresión de una quimoquina o de su receptor, o bien la interacción entre ambos, como, por ejemplo, la que permite el tráfico y el aflujo de leucocitos desde y hacia el órgano trasplantado. Esto afecta la inflamación e inhibe la respuesta inmune. Hace poco, en el FASAT Journal se publicó el aislamiento de una molécula, el MED-RANTES, que antagoniza el reconocimiento del RANTES por su receptor y que es capaz de neutralizar el daño tubular durante el rechazo agudo del trasplante renal en ratas. También afecta la repoblación de leucocitos en el sitio del rechazo.

Un ejemplo muy reciente de un antagonista sintético de CCR-1 es el que se conoce como BX471, que, según se publica en Journal of Biological Chemistry e Immunological Letters, mejora el resultado de trasplantes cardíacos y renales en ratas y conejos, respectivamente. En el caso del alotrasplante cardíaco en ratas, el efecto positivo se obtuvo combinando este compuesto sintético con ciclosporina A. En el caso de los conejos, el mejor resultado se reflejó en niveles más bajos de nitrógeno ureico y creatinina post trasplante.

Espero haber señalado las diferentes estrategias experimentales en desarrollo, orientadas a bloquear quimoquinas determinadas, o sus receptores, tratando de mejorar el resultado final de los alotrasplantes de órganos. Sobre la base de los trabajos de Fairchild, hemos visto que anticuerpos policlonales contra MIG (CXCL-9) prolongan significativamente la sobrevida de injertos de piel. Como ustedes saben, los injertos de piel son una prueba muy burda de los tratamientos anti-rechazo experimentales.

Los anticuerpos monoclonales contra CXCL-10 (conocida antes como IP-10, o proteína inflamatoria inducida por interferón), también prolongan la sobrevida de los injertos. Ya mencioné el DX471 como ejemplo específico de una molécula sintética que puede tener un efecto positivo sobre el trasplante de órganos.

También quisiera mencionar la posibilidad de terapia génica orientada a las quimoquinas o sus receptores. Blomberg y colaboradores publicaron hace poco, en Journal of Gen Therapy, los resultados de una estrategia a base de genes de "viroquinas" o quimoquinas producidas por virus. La introducción, por medio de un retrovirus, del gen que codifica para el MIP-2 viral en animales, inmediatamente antes del trasplante, prolonga de manera importante la sobrevida del alotrasplante cardíaco. También se logra mejor sobrevida con el traspaso, por medio de retrovirus, del gen del MC148, otra viroquina.

Hay, entonces, múltiples frentes de adelanto en la investigación experimental en este campo, incluso la terapia génica que anula o impide la producción de quimoquinas.

Mi propio laboratorio se ha interesado de manera especial por el papel de los leucocitos dendríticos en el trasplante de órganos. Estas importantes células presentadoras de antígenos participan tanto en la vía directa como en la indirecta del alorreconocimiento. Como todos los leucocitos, ellas también regulan la expresión de receptores de quimoquinas sobre sus membranas. Su respuesta a las quimoquinas determina su ubicación y su tránsito por el organismo, y su llegada hasta el órgano trasplantado. El aumento en la expresión de receptores para ciertas quimoquinas en su membrana les permite seguir una gradiente quimiotáctica para llegar y quedarse en ciertas zonas de tejido linfoide, donde se expresa aquella quimoquina que los ha atraído.

Por ejemplo, en un injerto de piel, las células dendríticas que están presentes en forma inmadura, como células especializadas en la captación del antígeno, al momento del injerto pasan por la sangre a los órganos linfoides secundarios, donde interactúan con las células T. Esta migración a los órganos linfoides y la posterior interacción está dirigida por quimoquinas y receptores para ellas.

Comprender los receptores para quimoquinas sobre las células dendríticas nos ha llevado a postular el que llamamos "paradigma del switch de los receptores de quimoquinas de las células dendríticas". La célula dendrítica inmadura, es decir, la que está presente en el interior de los aloinjertos y en la piel, expresa un espectro determinado de receptores CC. Estas son importantes en la regulación de su tránsito. Después del trasplante, a medida que madura y va abandonando el injerto, disminuye la expresión de CCR-1, CCR-5 y CCR-6, y aumenta notablemente la expresión de CCR-7. En cuanto a los respectivos ligandos de estos receptores, el tránsito de las células dendríticas desde el órgano trasplantado hasta los órganos linfoides secundarios está dirigido por MIP- 3- beta, ligando principal del CCR-7, receptor cuya expresión aumenta de manera más importante.

Por tanto, un enfoque conceptual para impedir la migración de las células dendríticas desde el órgano trasplantado hasta los órganos linfoides secundarios debe consistir en antagonizar esta vía del CCR-7-MIP-3-beta, ya sea con anticuerpos dirigidos contra el MIP-3-beta o con un antagonista sintético contra el receptor.

También es posible prevenir el rechazo del trasplante enfocando la estrategia en la migración de los linfocitos T desde el tejido linfoide hasta el alotrasplante. La forma más racional de abordar este aspecto, de acuerdo al conocimiento actual de la biología de las quimoquinas, es mediante el CXCR-3 sobre la célula T, porque es un receptor muy importante en la dirección del movimiento de estas células hacia el órgano trasplantado, pues reacciona con las quimoquinas proinflamatorias, los atrayentes normales de los linfocitos T al sitio del rechazo.

Conceptualmente, hemos llegado al punto en el cual podemos comenzar a visualizar la realización de nuevas estrategias para bloquear la migración de las células clave, como las células presentadoras de antígeno o las principales células efectoras, responsables de la destrucción del órgano rechazado.

Quisiera concluir esta presentación con un resumen de los principales puntos que he tratado de dejar en claro, en este campo tan complejo y aún más complicado por la terminología y los recientes cambios en ella, como es el caso de las quimoquinas.

Creo que es razonable decir que está surgiendo evidencia sobre cuáles son las quimoquinas más importantes que hay que considerar como objetivo para bloquearlas, lo que ya está demostrado en modelos animales. Falta aún determinar si los hallazgos en los modelos animales, en ratón, rata y conejo, se reproducen en el ser humano. Se podrá avanzar en este campo si aumentamos nuestro conocimiento molecular de las quimoquinas y los receptores para ellas, que se expresan en los alotrasplantes humanos que son rechazados y en los que son aceptados. En los próximos años, creo que se va a acumular suficiente experiencia sobre esto. Existe una diversidad de herramientas disponibles, como los anticuerpos monoclonales para quimoquinas, los ratones con nocáut específico, los equipos analíticos, como los que ya ha introducido Pharmogen, que nos permiten visualizar simultáneamente una amplia gama de quimoquinas y receptores, en biopsias de tejidos trasplantados, y establecer la intensidad de expresión de cada uno de ellos en los trasplantes humanos.

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