Resumen

Tradicionalmente, ha sido difícil aislar las células dendrítycas y complicado trabajar con ellas. El uso de factores de crecimiento recombinantes ha permitido generarlas a partir de precursores medulares y sanguíneos, lo que ha llevado a un aumento explosivo en el interés de la comunidad científica por estas células y su posible potencial terapéutico. Este potencial existe para los oncólogos, los alergólogos, los especialistas que tratan enfermedades autoinmunes y para quienes se interesen por los trasplantes de órganos y de médula ósea.

Las células dendríticas son células leucocíticas raras, de origen medular, presentes tanto en tejidos linfoides, como timo y médula ósea, como en los tejidos no linfoides, incluso aquellos que se trasplantan con mayor frecuencia. Expresan constitutivamente productos del sistema mayor de histocompatibilidad. En relación con el trasplante de órganos, ellos son los antígenos extraños, que se expresan sobre estos leucocitos dendríticos.

En el trasplante, las células dendríticas, residentes normales del tejido trasplantado, migran a los ganglios linfáticos y al bazo, y presentan los aloantígenos a los linfocitos T alorreactivos vírgenes. Por eso, hoy se consideran estas células como una herramienta potencial para regular la respuesta inmune en trasplante. Con tinción selectiva para productos del complejo mayor de histocompatibilidad, las células dendríticas son claramente visibles, con sus prolongaciones citoplasmáticas, en el parénquima de los órganos trasplantados, por ejemplo, en corazón o páncreas de rata.

Las células dendríticas inmaduras tienen la capacidad de fagocitar partículas. Si se aíslan células dendríticas de ganglio mesentérico de rata, se les permite fagocitar partículas de látex y se las inyecta en el animal receptor, se puede observar cómo migran a las zonas T de los órganos linfoides del receptor, donde interactúan íntimamente con gran número de linfocitos T. La interacción de las células dendríticas del donante con los linfocitos T del receptor es un evento inicial crítico en el desencadenamiento de la respuesta inmune contra el donante. En la actualidad, se estima que es posible manipular estas células en el laboratorio, para inducir tolerancia en vez de respuesta.

El concepto tradicional sobre las células dendríticas en trasplante las veía como leucocitos pasajeros que servían sólo para inducir el rechazo. Este concepto fue acuñado por Chris Larson, Peter Moroz y otros, hace unos doce o quince años. Bachelor y Locklor, en trasplante experimental en ratas, también apoyaron este concepto, estimando que las células dendríticas eran las principales causantes de la inducción de rechazo. Un punto de vista más contemporáneo, basado en resultados experimentales recientes, es que las células dendríticas tienen la capacidad de inducir, no sólo respuesta inmune sino también tolerancia. Por eso, al optimizar la capacidad tolerogénica de estas células, se podría inhibir el rechazo del injerto o incluso evitarlo. Existe también un aprovechamiento potencial de esta capacidad en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

En realidad, las células dendríticas tienen dos aspectos. Pueden inducir respuesta inmune, pero también pueden inducir tolerancia. Esto depende básicamente de la presencia o ausencia (o bloqueo) de moléculas coestimuladoras, participantes en la activación del linfocito T. Si no están las moléculas coestimuladoras, la célula dendrítica no activa el linfocito T sino que lo toleriza.

Las células dendríticas se originan a partir de células progenitoras CD44(+), en la médula ósea. Abandonan la médula ósea y circulan en la sangre como células inmaduras. Estas células inmaduras se encuentran también, como ya se dijo, en la mayoría de los órganos y en la piel, por lo que las células de Langerhans de la epidermis son en realidad células dendríticas de la piel. El factor de crecimiento más importante para estas células, en la médula y en la circulación, es el GM-CSF, el factor de crecimiento de granulocitos y monocitos. Hay otras citoquinas, como el TNF alfa y la interleuquina 4, que también promueven la diferenciación de células dendríticas a partir de sus precursores tempranos.

La manera más práctica de obtener células dendríticas humanas es cultivarlas a partir de monocitos adherentes circulantes. Hay muchos factores que favorecen la maduración de las células dendríticas inmaduras en la sangre o tejidos no linfoides, y las llevan a convertirse en células madura o células interdigitadas de los órganos linfoides secundarios. Entre estos factores están los lipopolisacáridos bacterianos, el TNF alfa, y el CD40 ligando, presente en la superficie de los linfocitos T.

Las células dendríticas están muy especializadas en la captación de antígenos, por lo que se sitúan en los portales de entrada de materias extrañas. Las células inmaduras expresan una serie de marcadores que comparten también los monocitos, pero carecen de las moléculas coestimuladoras, en particular CD 80 y CD 86, y tienen poca expresión en la superficie de moléculas de histocompatibilidad clase II. Debido a la ausencia de estas moléculas, son débiles como activadores de linfocitos T y por eso se las considera potencialmente tolerogénicas.

Las células dendríticas maduras, por otra parte, han perdido los marcadores compartidos con monocitos, expresan gran cantidad de moléculas coestimuladoras y de clase II, como también clase I, y son extremadamente eficientes como activadoras de linfocitos T. Estas células interesan mucho a los oncólogos, por la posibilidad de aprovecharlas para potenciar la respuesta específica al tumor.

A los clínicos, que necesitan disminuir o evitar la respuesta inmune para suspender, en lo posible, los inmunosupresores, les interesan las células inmaduras, posiblemente manipuladas genéticamente, para bloquear las moléculas coestimuladoras. Este es el nuevo enfoque de la terapia celular para inmunosupresión.

Me voy a referir básicamente a las células dendríticas inmaduras que se encuentran en los tejidos no linfoides, las que expresan constitutivamente, aunque en poca cantidad, moléculas de clase II (es decir, la primera señal de activación), pero son deficitarias en moléculas coestimuladoras (es decir, segunda señal). Estas son las células potencialmente tolerogénicas.

Hace algunos años, junto con mis colegas, en especial la Dra. Lina Lu, en mi laboratorio, comenzamos a investigar las células dendríticas inmaduras y a compararlas con las maduras. Las células se obtenían de médula ósea de ratón y se cultivaban en concentraciones bajas de GM-CSF, o en presencia de GM-CSF más interleuquina 4. Las células cultivadas con GM-CSF sólo expresaban moléculas clase II o Ia, pero eran deficientes en CD 86 y CD80. En cambio, las cultivadas con GM-CSF más IL-4 expresaban mayor cantidad de clase II y altos niveles de CD 80 y CD 86.

La pregunta que se planteó entonces fue si estas células inmaduras serían capaces de prolongar la sobrevida de un trasplante. Se cultivaron células dendríticas de la médula ósea del ratón donante y se inyectaron por vía intravenosa en los receptores. Se observó un aumento significativo de la sobrevida del injerto, donante específica, y en total ausencia de medidas inmunosupresoras. En cambio, las células maduras administradas antes del trasplante aceleran el rechazo. Tenemos, entonces, ambos aspectos de la función de las células dendríticas: su efecto estimulador y su efecto tolerogénico.

Una publicación del European Journal of Immunology, cuyos resultados se han reproducido en forma independiente, en un modelo de trasplante de corazón murino, señala que la inyección intravenosa de células dendríticas inmaduras del donante, una semana antes del trasplante, induce una sobrevida indefinida del alotrasplante cardíaco. Los animales no reciben ningún tratamiento inmunosupresor y el trasplante se realiza contra barrera MHC.

Un aspecto importante de estas observaciones es que el dramático efecto terapéutico dependería en gran medida del momento en que se administran las células del donante. Si las células se dan dos semanas o tres días antes del trasplante, el efecto terapéutico se pierde. Esto lo han observado varios grupos, incluso el nuestro, hace unos seis o siete años, y no entendemos por qué.

Sin embargo, estos resultados ilustran la sensibilidad de este tratamiento, en cuanto al tiempo de administración de las células. Por eso, los estudios actuales de nuestro grupo y de otros se orientan a potenciar más la tolerogenicidad de las células inmaduras, con miras a disminuir esta dependencia tan crítica del tiempo de administración.

Es de considerable interés que numerosos factores, algunos de uso habitual como fármacos inmunosupresores, disminuyen la maduración de las células dendríticas en el laboratorio y promueven su capacidad tolerogénica. Algunos de ellos se conocen desde hace más de diez años, como la radiación UV. Otros son la interleuquina 10, que inhibe la expresión de moléculas coestimuladoras sobre células humanas y de ratón, y la proteína de fusión quimérica CTL 4 IG, que bloquea la vía B7-CD28, ya que se une a las moléculas B7 sobre la célula dendrítica, bloquea su capacidad coestimuladora y la hace tolerogénica . También tienen ese efecto la prostaglandina E2, la vitamina D3, los esteroides, la ciclosporina A, el micofenolato mofetil, deoxispergualina, y, de comunicación reciente, los salicilatos, es decir, la aspirina.

En mi laboratorio, el Dr. Hogart Huksteen demostró que la Aspirina, el antiinflamatorio más ampliamente disponible y utilizado, inhibe la maduración de las células dendríticas, por disminución de la translocación nuclear del factor nuclear kappa-beta, proteína reguladora de transcripción génica, cuya activación es crítica para la maduración de estas células.

Entre los factores que pueden promover la tolerogenicidad de las células dendríticas in vivo, se cuentan varios anticuerpos monoclonales, como los anti células T, anti Il-12, anti Il-13 y también anti CD40 ligando. Estos factores, entre ellos también la irradiación linfoide total y el suero antilinfocitario, inducen una prolongación de la sobrevida de injertos cutáneos y cardíacos en modelos murinos.

Aunque no se ha trabajado mucho en la investigación del efecto de otros agentes in vivo, sobre la base de los resultados ya mostrados, es muy probable que se demuestre que ciertos fármacos antiinflamatorios e inmunosupresores de uso habitual también inhiban la maduración de las células dendríticas in vivo, como ya quedó demostrado con la deoxispergualina. Esto permite comprender mejor cómo actúa la inmunosupresión clínica, ya que tiene como blanco no sólo los linfocitos sino también las células dendríticas.

Otro trabajo de la Dra. Lina Lu, de mi laboratorio, demuestra que la administración de células dendríticas inmaduras del donante, en combinación con un anticuerpo monoclonal anti CD40-ligando, potencia marcadamente la capacidad de las células dendríticas para prolongar la sobrevida del alotrasplante cardíaco en ratones. Las células dendríticas solas prolongan la sobrevida de 12 a 23 días, el anticuerpo solo no tiene efecto y la combinación de ambos, una semana antes del trasplante, prolonga la sobrevida a 80 días. En 40% de los animales, la sobrevida fue indefinida, es decir, superior a los 100 días del experimento, en ausencia total de terapia inmunosupresora de otro tipo.

En los animales que recibieron las células dendríticas inmaduras del donante junto con el anti CD40-ligando, la sobrevida prolongada del corazón trasplantado se acompañó de un microquimerismo persistente en la médula ósea. En aquellos animales cuyos injertos sobrevivieron más de 100 días, se pudo observar en el bazo un número relativamente considerable de células de donante MHC(+), con la localización y la morfología de leucocitos dendríticos, ubicados en las zonas T dependientes. Esto da evidencia circunstancial de la importancia que tiene la persistencia de las células dendríticas inmaduras del donante en la inducción de la tolerancia y, probablemente, en su permanencia, en este modelo experimental.

Quiero concentrarme ahora en un aspecto importante de la ontogenia y desarrollo de las células dendríticas. Como ya se dijo, derivan de precursores medulares CD34(+); en su maduración es muy importante el GM-CSF; y comparten algunas características con los macrófagos. Esto se refiere a las llamadas células dendríticas mieloides.

Se ha despertado un interés creciente en la posible existencia de una segunda línea de células dendríticas, las linfoides, que tienen mayor afinidad con los linfocitos. En la
actualidad hay bastante evidencia de la existencia, en ratones, de esta población diferente de células dendríticas. Son CD8 alfa(+), a diferencia de las mieloides, que son CD8 alfa(-). La diferencia más importante es que las células CD8 alfa(+), que son constitutivas en el timo, se originan, no sólo en los progenitores linfoides comisionados sino también en los progenitores mieloides.

En el ratón y también en el ser humano, se han descrito además las células dendríticas asociadas a linfocitos B. Por lo tanto, el espectro de las células dendríticas está aumentando progresivamente. Está claro que hay diferentes líneas, aunque hay controversias respecto de su caracterización.

En el ratón, se ha postulado que las células dendríticas asociadas a linfocitos CD8 alfa(+) son tolerogénicas. Son la fuente principal de péptidos propios, presentados en clase II, y se ha postulado recientemente que serían las causantes de que prendan los trasplantes de células troncales contra barrera de MHC. Hay cada vez más evidencia de que en el ratón habría una línea de células dendríticas, las CD8 alfa(+), que tendrían propiedades tolerogénicas.

En nuestro grupo, el Dr. Peta O'Connell realizó experimentos en que las células dendríticas CD8 alfa(+) maduras, muy purificadas, prolongaron la sobrevida de ciertos trasplantes. Esto difiere bastante de lo que he dicho hasta ahora: he aquí un ejemplo de un tipo particular de células dendríticas que son capaces de promover la sobrevida de trasplantes, aunque sean maduras. Las células provenían de la misma cepa del donante del corazón trasplantado y se administraron una semana antes del trasplante. Sería, entonces, una población de células capaces de modificar la respuesta, independientemente de su estado de maduración.

Nos interesó mucho la contraparte humana de estas células dendríticas CD8 alfa(+) del ratón. En la sangre periférica humana normal es posible identificar, con citometría de flujo, las llamadas células "dendríticas plasmocitoides" o "relacionadas con linfocitos". Son raras, pero se pueden movilizar con factores de crecimiento hematopoyéticos, en especial el G-CSF, con lo cual aumenta su número. Si se demuestra que estas células tienen propiedades tolerogénicas, como su contraparte murina, se puede visualizar una manera de aumentar su número y transferirlas en forma adoptiva al receptor, en los casos de trasplante electivo de riñón o de hígado con donante vivo relacionado, para promover la tolerancia. Una variante de esto es lo que se está haciendo actualmente, en forma experimental, en la Universidad de Pittsburgh, donde se está transfundiendo médula ósea no modificada de donante en el receptor, con miras a inducir tolerancia.

Se sabe que hay muchos genes cuyos productos tienen propiedades inmunosupresoras. Por ejemplo, la Il-10, específicamente la IL-10 viral, el fas-ligando o ligando CD95 y algunas proteínas de fusión, han demostrado la capacidad de prolongar la sobrevida de injertos en sistemas experimentales.

Hace algunos años, decidimos manipular genéticamente las células dendríticas para que expresaran uno o más de esos productos inmunosupresores. Nuestro planteamiento era que la infusión de un número relativamente pequeño de células dendríticas, modificadas genéticamente para expresar genes inmunosupresores, podría permitir una menor reacción al trasplante, ya que estas células viajan selectivamente a los microambientes donde ocurre la fase crítica de presentación de los antígenos a los linfocitos T alorreactivos. Además, en teoría, con ello se debería poder minimizar la necesidad de utilizar agentes inmunosupresores y reducir así los efectos perjudiciales de la inmunosupresión sistémica.

Se utilizó una gran diversidad de métodos: retrovirus, adenovirus, lipofección y otros, para introducir los genes en las células. Las células dendríticas transfectadas efectivamente con retrovirus, que producen IL-10, tienen muy alterada su capacidad de inducir células T citotóxicas en el laboratorio. El año pasado se publicó en el Journal of Immunology el trabajo de Min et al., que ejemplifica la prolongación de la sobrevida de órganos trasplantados, con células dendríticas manipuladas genéticamente. En este caso, utilizaron la inyección intraperitoneal de células dendríticas que expresaban fas-ligando del donante, después del trasplante, y se obtuvo una prolongación significativa de la sobrevida de un trasplante vascularizado de corazón. No se indujo tolerancia, ya que la sobrevida del trasplante no fue indefinida.

Esto puede significar que la transducción de las células a expresar fas-ligando fue más bien ineficiente. Es posible que la lipofección no sea muy eficaz, pero si se optimiza el método de modificación genética se podría potenciar aún más la sobrevida del injerto.

El estudio del Dr. Takayama, de nuestro grupo, obtiene el producto transgénico CTL-4Ig por transducción adenoviral. Las células dendríticas que expresan el CTL-4 Ig tienen una marcada disminución de su capacidad de estimular células T alogeneicas. Sobreviven en mayor cantidad, y por tiempo más prolongado, en receptores alogeneicos. Siete días después de la infusión intravenosa, las células dendríticas del donante, transducidas para expresar el CTL-4Ig, sobreviven, en número importante, en los tejidos linfoides del receptor. Esto significa la presencia continua de células dendríticas del donante y se produce una sustancia inmunosupresora, en el sitio preciso donde se inicia la reacción de los linfocitos T contra el trasplante.

Estas células dendríticas transducidas con CTL-4Ig desvían la respuesta inmune del receptor, predominantemente, hacia TH2. Los análisis ex vivo de la reactividad antidonante demuestran una reducción significativa en la producción de gama interferón y un marcado aumento en la producción de citoquinas TH2, como se aprecia por los altos niveles de Il-4 e Il-10.

La estrategia más reciente, en nuestro laboratorio, es la ingeniería de las células dendríticas con adenovirus que contienen el código para CTL-4 Ig. Para inhibir la maduración de las células dendríticas transducidas con el adenovirus, se utilizan oligodeoxinucleótidos anti-sentido, que bloquean la translocación del factorkappa-beta hacia el núcleo. Si las células dendríticas así tratadas, que expresan CTL-4Ig, se infunden una semana antes del trasplante, se prolonga notablemente la sobrevida del alotrasplante cardíaco, con una media de 71 días, en comparación con 10 días en los animales no tratados.

No dispongo de tiempo para extenderme en los grupos controlados, pero ilustran muy bien que las células dendríticas del donante, establemente inmaduras por inhibición del factor kappa-beta y transducidas con adenovirus para expresar moléculas inmunosupresoras, son capaces de prolongar de manera importante la sobrevida de los injertos.

Como comentario final, voy a tratar de resumir las estrategias para promover tolerancia, con uso de células dendríticas inmaduras o modificadas genéticamente. Las células dendríticas inmaduras, cultivadas con bajas concentraciones de GM-CSF o expuestas a citoquinas inmunosupresoras, como IL-10 o TGF-beta, o a drogas inmunosupresoras, como esteroides, micofenolato mofetil, o a aspirina, que también inhibe la maduración, son capaces de inhibir la activación de los linfocitos T y promueven la tolerancia T.

La transferencia génica a las células dendríticas, que hace que expresen productos transgénicos, también potencia su tolerogenicidad, como se vio con el gen CTL-4 Ig o la transducción del fas-ligando, que produce la muerte de células T reactivas a los antígenos del donante, presentes sobre las células dendríticas, o en el bloqueo de coestimuladores para las células T, por bloqueo de los contrarreceptores. En caso del CTL-4 Ig, este bloqueo es de la vía B7-CT28

En el futuro, vamos a ver la introducción de otros genes para potenciar la tolerogenicidad de las células dendríticas. Es un campo que, aunque en su primera infancia, me parece muy prometedor para el tratamiento, no sólo del rechazo de trasplantes sino también de las enfermedades autoinmunes. En ellas el antígeno putativo es un autoantígeno, como el que se encuentra en la diabetes tipo I y en la esclerosis múltiple.

El último punto es que hoy también es posible generar células dendríticas a partir de células troncales embrionarias. En una publicación reciente, Fairchild y Waldmann señalan que, a partir de células embrionarias murinas, en el laboratorio se pueden generar células que claramente son dendríticas, por morfología y por fenotipo de superficie.

Como conclusión, se pueden generar células dendríticas, diseñadas especialmente en el laboratorio, que expresen diferentes productos génicos inmunosupresores. Se pueden generar a partir de células embrionarias y se pueden establecer líneas de cultivo continuas de células que expresen moléculas tolerogénicas existentes y nuevas. Entre las moléculas tolerogénicas nuevas están, por ejemplo, OX-2, CT31 y otras.

Sólo falta, para terminar, agradecer a quienes contribuyeron desde muy diferentes aspectos, al desarrollo de estos adelantos, es decir, a todos los integrantes del equipo de mi laboratorio, a los colaboradores y a las instituciones que lo han apoyado.

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