Resumen

Introducción

En esta exposición cubriré algunos aspectos de lo que es una aproximación realmente futurista en el tratamiento del rechazo de injertos. Me refiero a la terapia génica. Quisiera comenzar presentando la transferencia génica para lograr inmunosupresión. Esto significa el uso de vectores virales o no virales para llevar moléculas al injerto, con el fin de provocar inmunosupresión local y sistémica. Así, en principio, sería posible reducir al mínimo o prevenir los conocidos efectos perjudiciales del uso sistémico de agentes inmunosupresores.

La terapia génica ofrece el potencial de llevar inmunosupresores, que en esta etapa son, en esencia, inmunosupresores inespecíficos, a la interfaz del sistema inmune con los aloantígenos del donante. Nuevamente, en principio, la terapia génica permite el transporte de moléculas, con predominio de péptidos, las que de otra manera posiblemente no serían útiles por su vida media corta, el costo de transportar cantidades muy grandes sistémicamente o las dificultades tal vez inherentes en la administración de estas moléculas.

Expresión ectópica de genes en el trasplante de órganos

Quiero dedicar algo de tiempo a un análisis esquemático de la diversidad de medios posibles para lograr la expresión ectópica de genes en el trasplante de órganos, para llegar a conformar efectos citoprotectores o efectos inmunomoduladores, en cuanto a la sobrevida del injerto y la respuesta inmune del huésped.

Si el órgano injertado se modifica genéticamente mediante el transporte de genes que, por ejemplo, inhiben la adhesión intercelular, por medio de la secreción de ciertas moléculas, se antagonizará o inhibirá la interacción de las células inflamatorias infiltrantes con las células endoteliales del injerto. Esta es una manera potencial de inhibir o frustrar la respuesta del huésped.

En cambio, o además, la modificación genética del trasplante puede promover la secreción de moléculas inmunosupresoras, en particular citoquinas, como IL-10 (interleuquina 10) y TGF-beta (factor de crecimiento transformante beta). Ambas se han insertado ya, genéticamente, en injertos experimentales, lo que mejoró el resultado. Otra molécula es la IL-4 que, como la IL-10 y las citoquinas TH2 (linfocito TH2), inhiben la respuesta del linfocito TH1. También se puede inducir la secreción, por las células del injerto, de moléculas que bloquean la coestimulación. Hoy ya se habló del CTL-4IG soluble, que bloquea la vía de coestimulación del B7-CD28. Productos génicos de alternativa que se podrían introducir en el injerto son, por ejemplo, el gen codificante para CD40 soluble. La producción de CD 40 soluble antagonizaría el CD40 y su interacción con el CD40-ligando, inhibiendo así la coestimulación de las células T, y reduciría su activación y su respuesta.

Otra aproximación es introducir genes que codifican para moléculas que inhibirían el complemento, lo que sería más aplicable al xenotrasplante. Un ejemplo de producto transgénico, que se podría emplear para inhibir el ataque dependiente de complemento, es el factor acelerador del decaimiento o DAF. Otra manera posible es la inducción de expresión, por el órgano trasplantado, de altos niveles de ligandos inductores de DAF, como el fas-ligando o el receptor de TNF (factor de necrosis tumoral). Existen otros miembros de la familia de receptores de TNF que son ligandos inductores de apoptosis, en los cuales hay interés creciente. Promueven la muerte apoptótica de los linfocitos T alorreactivos activados y son otra manera posible de modificar el órgano trasplantado para inducir la no reactividad o inhibir la respuesta del receptor. Por último, otro ámbito en curso de investigación es el de los inhibidores de quimoquinas. Ayer hablamos del papel de las quimoquinas en la reacción inflamatoria y en la regulación de las células presentadoras de antígenos (CPA) y de los linfocitos T. La producción de antagonistas de las quimoquinas, por el injerto, es otro posible enfoque de la terapia génica en el rechazo de injertos.

Terapia génica e isquemia de reperfusión

Me referiré a un enfoque conceptual de la reducción o minimización de la isquemia de reperfusión, uno de los problemas más conocidos como causa de ineficacia del trasplante de órganos.

Hay un sinnúmero de moléculas y vías que son los blancos potenciales de esta intervención. Por ejemplo, la producción de superóxido o de peróxidos, la inducción de apoptosis, la vía de la IL-1 y el receptor de IL-1, o la del TNF y el receptor de TNF. La sobreexpresión de moduladores potenciales que específicamente apunten a estas moléculas se espera que reduzca el daño isquémico en el injerto. En principio, si se modifica genéticamente el injerto para que sobreexprese una o más de estas moléculas, sería posible intervenir en la interacción de las distintas vías y mejorar el resultado del injerto. Por ejemplo, si se quiere reducir el grado de apoptosis en el órgano perfundido para trasplante, la sobreexpresión de productos génicos como el bcl-2 o el bcl-XL, u otras moléculas que regulan negativamente la apoptosis, sería potencialmente beneficiosa en reducir este problema, que se asocia con una menor calidad del órgano que se va a injertar. En forma similar, la expresión de receptores solubles de TNF por el injerto bloquearía la interacción entre el TNF y su receptor y, en principio, debería reducir el daño resultante de la liberación de TNF.

Terapia génica y coestimulación

La coestimulación se refiere a la segunda señal de las CPA (células presentadoras de antígenos). Las CPA llegan del donante, pero también, como dijimos en relación con el alorreconocimiento indirecto, hay CPA del huésped que también coestimulan y producen las segundas señales para la activación de linfocitos T. Los genes que potencialmente se podrían usar para antagonizar la coestimulación son los que podrían bloquear moléculas, como I-CAM, LFA-1, LFA-3, CD2 u otra vía que participa en la coestimulación de linfocitos T. Otros genes potenciales son los que codifican para CTL-4IG, CD80 soluble, CD86 soluble, CD40 soluble. Estos productos génicos antagonizarían las vías de coestimulación y se esperaría que inhibieran la inducción de la activación y proliferación de linfocitos T.

Otra aproximación es la transferencia de genes que codifican receptores de citoquinas solubles. Un buen ejemplo de ella sería el receptor soluble de IL-2, que antagoniza la vía del receptor de IL-2. Hoy se hace esto administrando anticuerpos monoclonales, por vía sistémica, al receptor del trasplante. Al localizar la producción de este producto en el injerto mediante la manipulación génica, se debería lograr, en principio, el mismo efecto, pero reduciendo al mínimo los problemas del uso sistémico de anticuerpos monoclonales.

Métodos para la transferencia de genes

a) Métodos sin vectores virales
Los métodos de transferencia de genes codificantes para las moléculas mencionadas más arriba, con miras a reducir el daño por reperfusión o disminuir el ataque inmunológico por bloqueo de la interacción del linfocito T con la CPA, son varios: los métodos no virales son el uso de ADN denudado, la transferencia génica en liposomas o el uso de conjugados de ADN. Todos los procedimientos no virales conducen a la expresión transitoria de los genes transferidos y son eficaces para transfectar células que no se están dividiendo. Esto constituye una ventaja en comparación con los vectores retrovirales, los que necesitan células en mitosis. Como se pueden utilizar en células que no están en mitosis, son de gran utilidad en el traspaso de genes a células parenquimatosas del potencial injerto de tejido u órgano que no estén en división.

En la literatura reciente, un ejemplo de transporte no viral de genes a un aloinjerto se refiere a aloinjertos de islotes pancreáticos en ratones. El método que se usa aquí es distinto a los que se mencionaron anteriormente; es un método no viral que se basa en el uso de un "cañón génico" para transferir el gen al injerto en forma balística o de disparo. Para esto se necesita un dispositivo, el cañón génico, que propague rápidamente partículas en el interior de la célula o tejido de interés. Las partículas así transportadas están recubiertas con el gen, en este caso se trabaja con el que codifica para CTL-4IG, lo que conferirá a la célula blanco la capacidad de fabricar el producto transgénico. El CTL-4IG es un buen ejemplo de moléculas que se pueden transferir con el método del cañón génico. El transporte de genes por este método está limitado por la distancia a la que los genes transferidos pueden llegar, pero es muy aplicable si se tienen células aisladas, como las células de islotes pancreáticos. Este método de transporte génico se puede usar in vivo, pero está limitado, por ejemplo, al transporte de genes a células de la epidermis, donde la profundidad del tejido es poca.

El trabajo en cuestión demuestra que, en el grupo de animales que recibieron células de islote transfectadas con el gen CTL -4IG por el método balístico, la reacción es variable. En algunos la sobrevida es corta, pero en otros es muy prolongada, con un promedio de sobrevida del injerto de 70 días, en comparación con un promedio de 13 días en los animales del grupo control, que recibieron injertos transfectados con un gen no relacionado, que no llevaba moléculas inmunosupresoras. Este trabajo reciente es un buen ejemplo de un modelo experimental de transporte génico con método balístico y, en consecuencia, la prolongación de la supervivencia del aloinjerto. La funcionalidad de los aloinjertos pancreáticos se confirmó por nefrectomía. Los injertos se colocaron bajo la cápsula renal. La eliminación de ese riñón se manifestó en la aparición de niveles altos de glucosa sanguínea, lo que indica que la supervivencia de estos animales se debió, en realidad, a estos aloinjertos modificados genéticamente.

Otro ejemplo reciente, publicado en Transplantation, esta vez con trasplante de órgano sólido, es un trabajo en ratas con injerto de hígado transfectado por perfusión con ADN de plasmidio. En este caso, el gen transferido codifica para moléculas inductoras de muerte, el fas-ligando o ligando CD95. La expresión de fas-ligando en el tejido trasplantado llevará a la interacción de ellos con moléculas fas expresadas en la superficie de las células infamatorias infiltrantes en el injerto, incluso linfocitos T. Esta interacción promueve la muerte apoptótica de las células que expresan fas en su superficie y que interactúan con el producto transgénico. Los animales del grupo que recibió los injertos de hígado expresando el fas-ligando transgénico tuvieron una sobrevida mucho mas prolongada, en algunos casos bastante larga, tanto de los animales como de los órganos trasplantados. El grupo control, transfectado sólo con el gen reportero, codificante para beta-galactosidasa, no mostró ningún efecto sobre la sobrevida del injerto.

En esta publicación, la expresión en el parénquima hepático del fas-ligando transfectado se confirmó con técnicas de tinción inmunohistoquíumicas. La coloración rojo-anaranjada indicaba la presencia de fas-ligando expresado en el tejido hepático. Los hígados perfundidos con el DNA codificante para el gen control, betagalactidasa, como era de esperar, no mostraron evidencia inmunohistoquímica de expresión de las moléculas proteicas transgénicas. La expresión de fas-ligando se detectó tres días después de la transferencia génica.

En este trabajo, en particular, se demostró la muerte por apoptosis de las células infiltrantes, mediante una técnica llamada tinción de "túnel", que permite reconocer las células apoptóticas. Los autores sostienen que las células apoptóticas observadas son linfocitos T, ya que aseguran que las caracterizaron como tales mediante tinciones para antígeno de linfocito T de rata, el R-73. Sostienen que las células en curso de apoptosis expresan el antigeno de LT, por lo cual apoyan que los LT infiltrantes en el injerto se destruyen debido a la expresión del fas-ligando en el injerto hepático genéticamente modificado. El estudio histológico se realizó catorce días después del trasplante, es decir, una cantidad importante de días después de que el injerto modificado genéticamente se introdujera en el receptor.

He presentado dos ejemplos de métodos no virales: uno que transfiere genes por medio del "cañón génico", limitado a transplante de células, como el ejemplo de los islotes pancreáticos; el otro, con perfusión del injerto con DNA denudado, para permitir la incorporación del gen en células de parénquima de un órgano y así expresar las moléculas transgénicas. Como sostienen los autores del trabajo, en este caso la expresión de estas moléculas lleva a la apoptosis, por lo menos, de una proporción significativa de los LT infiltrantes en el injerto, concomitante con una sobrevida más prolongada de éste.

b) Métodos con vectores virales
El uso de vectores virales ha recibido mucho más atención en los trabajos sobre transferencia génica en trasplante experimental de órganos. Se ha estudiado una gran diversidad de vectores virales. Éstos son principalmente adenovirus o retrovirus, pero también hay algunos ejemplos de lentivirus, virus herpes simplex y, aunque con experiencia limitada, virus asociados a adenovirus.

En cuanto a la estabilidad de la transferencia, tanto retrovirus como lentivirus y tal vez los asociados a adenovirus, probablemente sean el vector adecuado para una transferencia génica estable, con expresión relativamente prolongada de los productos transgénicos. Con adenovirus, la expresión del gen transferido es más transitoria, lo mismo que con el uso de virus herpes simplex. Los retrovirus sólo infectan células en división y se necesitan células en mitosis para la incorporación del gen retroviral. Los otros vectores virales posiblemente sean capaces de infectar células que no se están dividiendo. Esto sería una ventaja característica, en términos de transferencia de genes en células parenquimatosas del órgano por injertar, que no se están replicando.

Quisiera mostrar un trabajo del Instituto de Transplantes del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh, donde se ha intentado maximizar la expresión de los transgenes con el uso de un adenovirus. Antes de esto, voy a mencionar dos publicaciones relativamente recientes sobre trasplante hepático experimental, una de Shakad y cols. (Trasplantation, 1995) y otra de Shoreshi y cols (Trasplant International, 1997), en las cuales se ha utilizado adenovirus para transferir el gen de interés, CTL-4IG, y el gen reportero LAK-C. En ambos trabajos, los genes se introdujeron por medio de perfusión del injerto. Esto generalmente exige títulos altos de virus, del orden de 5x1010 partículas, en un estudio, y 1x1010 partículas virales equivalentes, en el otro. En el trabajo de Shakad, la eficacia de la transferencia génica es más bien baja. Sólo alrededor de un cuarto de las células parenquimatosas del hígado mostraron evidencia de expresión transgénica.

Es importante que, históricamente, se dispone de documentos que prueban la viabilidad de llevar el virus, con el gen que se va a tranfectar, hacia los hepatocitos mediante la perfusión hepática, por medio ya sea de la vena porta o de la arteria hepática, lo que conduce a una expresión funcional del producto transgénico, en este caso CTL-4IG o el reportero LAK-C.

Mis colegas Enrico Marassi y David Geller, con la colaboración de Thomas Starzl, querían identificar una técnica para maximizar o mejorar el transporte de genes con uso de adenovirus, en el trasplante hepático en ratas. Usaron el enfoque de Shakad y otros, y perfundieron el hígado por medio de la vena porta, o de la porta y la arteria hepática en conjunto, con clampeo del flujo de salida desde el territorio de los vasos de perfusión. Incubaron los hígados en frío durante tres horas y los trasplantaron a receptores singeneicos, para no recurrir a inmunosupresión. Lo que interesaba probar era si la perfusión U con clampeo podría reforzar la expresión del producto transgénico.

En cortes histológicos practicados dos días post transplante, se observó que los hígados perfundidos vía porta mostraron clara evidencia de expresión de LAK-C transgénico con distribución focal. La perfusión vía vena porta y arteria hepática reforzó notoriamente el nivel de expresión transgénica, confirmado por análisis cuantitativo. La perfusión vía arteria hepática y vena porta, con clampeo del flujo de salida durante el tiempo de incubación, llevó a la maximización de la expresión transgénica en el hígado trasplantado. Esto constituye un avance reciente para reforzar la expresión de productos transgénicos en el trasplante de órganos.

La eficacia de este método para productos transgénicos inmunosupresores no se ha evaluado aún, pero, según los datos presentados, se esperaría una expresión reforzada de los productos transgénicos como el CTL-4IG y otras moléculas inmunosupresoras, lo que llevaría a una mayor eficacia, en cuanto a sobrevida del injerto.

Volviendo al trabajo de Abby Shakad y cols, de la Universidad de Pennsylvania, se tiene la comprobación del principio teórico de que la transferencia génica mediada por adenovirus, en aloinjertos hepáticos conservados en frío, culmina en la prolongación de la sobrevida del trasplante. Su trabajo, en un modelo experimental en ratas, fue publicado en Nature Medicine y los resultados son el que los autores consideran un sistema viable y potencialmente relevante y practicable en la clínica, para transporte de genes que codifican para proteínas capaces de inhibir la respuesta aloinmune. Sus datos aportan una cantidad importante de información respecto al valor comparativo de esta técnica para prolongar la sobrevida del injerto, con aplicación de un enfoque más convencional. La perfusión fría con un vector adenoviral con el gen control, nuevamente el gen reportero LAK-C, y la posterior introducción del injerto hepático en un receptor alogeneico, no afectó mayormente el tiempo de sobrevida del injerto. Si se usa el mismo procedimiento de perfusión, pero el vector adenoviral codifica para la molécula inmunosupresora CTL4-IG, se observa una marcada prolongación en la sobrevida del aloinjerto. En su mayoría, los animales sobrevivieron durante un tiempo superior a cien días, plazo que se considera indefinido.

Se compara con la eficacia de la proteina CTL-4IG intraperitoneal en dosis de 1mg, es decir, administración sistémica, dos días post transplante. Años atrás se demostró que la administración intraperitoneal de esta proteína podía prolongar notablemente la sobrevida del injerto, pero con el resultado de inmunosupresión sistémica, la que puede interferir con la resistencia a infecciones por virus u otros agentes. En este caso, el transporte de genes permite localizar el efecto, con éxito en la prolongación de la sobrevida y sin existir niveles sistémicos altos de los productos inmunosupresores transgénicos.

Otro enfoque del transporte de genes en injerto de órganos es la transferencia por medio de retrovirus. Hay que recordar que estos virus exigen células en división para incorporar el gen de interés. Datos recientes, publicados en Journal Immunology y en Transplantation, demuestran que es posible prolongar la sobrevida del corazón trasplantado, en ratas, si se usa un vector retroviral que codifica para IL-10. El principio de expresión del producto génico se comprueba por la expresión del gen reportero LAK-C, en el aloinjerto cardíaco, en el cual se introdujo directamente el retrovirus que contenía el gen, antes de ponerlo en el receptor.

La sobrevida del injerto se prolonga en forma notoria cuando el vector retroviral contiene el gen para IL-10, en este caso IL-10 viral, que carece de algunos efectos inmunoestimulantes de la IL-10 de mamíferos. Así, con la transferencia de genes sólo al tejido que se va a transplantar, se obtiene una prolongación muy satisfactoria de la sobrevida del injerto. Los autores también demostraron que la inmunosupresión con IL-10 era sólo local. No existía inmunosupresión en sitios distantes del injerto.

La transferencia de la IL-10 viral produjo una marcada inhibición de la actividad de los LT CD8(+) contra el donante. Los productos transgénicos reducen el número de LT citotóxicos en el interior del injerto. En la población total de LT que infiltra el injerto, la incidencia de precursores de LT citotóxicos está marcadamente disminuida.

Aplicaciones futuras de la terapia génica en el rechazo de injertos

Me gustaría terminar esta exposición refiriéndome brevemente a lo que es, quizá, la más futurista de las aplicaciones de la terapia génica en trasplante de órganos: la ingeniería genética de animales clonados. Todos conocen los trabajos publicados hace alrededor de un año, en Nature, sobre la producción de cerdos clonados, un logro de la empresa PPL. Estos cerdos clonados podrían ser potenciales donantes de corazones u otros órganos para trasplante en clínica.

El problema principal que enfrenta el xenotrasplante de órganos es el rechazo hiperagudo. Algunos de los métodos con los cuales se podría manipular estos animales con ingeniería genética, para evitar este problema, son, por ejemplo, conseguir que los cerdos transgénicos sobreexpresen el gen de fucosyl transferasa, cuyo producto competiría con el substrato para la molécula alfa-GAL, la principal instigadora de ataque general al xenotrasplante. Otra posibilidad es el nocáut del gen del cerdo que codifica para esta molécula antigénica, causante del rechazo humoral hiperagudo. Este es un enfoque futurista. Los cerdos transgénicos pueden expresan proteínas reguladoras del complemento humano, incluso el DAF (factor acelerador del decaimiento). Incorporadas estas moléculas en los órganos de los cerdos, éstos se podrían usar en el contexto de xenotrasplantes en receptores humanos.

Así, el uso de cerdos, clonados y manipulados genéticamente, como una fuente potencial de órganos para transplante, podría formar parte de la solución del problema de la escasez de órganos, gran limitante para el éxito general del trasplante de órganos

En conclusión, existen pruebas sobre el concepto de que la transferencia génica de moléculas inmunosupresoras puede prolongar la sobrevida e, incluso, alcanzar el éxito indefinido del aloinjerto de órganos. Por ahora, hay que resolver cuál es la mejor modalidad técnica, en cuanto a vectores. Otro campo, que está aún en la primera infancia y que también necesita resolución, es la respuesta inmune a los componentes de los vectores. Los vectores adenovirales, por ejemplo, son inmunogénicos e inducen una respuesta citotóxica hacia el vector. También espera estudio la respuesta inmune al producto transgénico, las cuestiones relacionadas con la entrada de los vectores en los compartimientos de las CPA y la influencia de la respuesta inmune inespecífica sobre la función del gen transferido.

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