Resumen

Introducción

En esta conferencia se hablará del papel que desempeña el número de podocitos en la proteinuria y en la glomeruloesclerosis. Con este objetivo, se analizarán cuatro aspectos: primero, qué pasa con el número de podocitos en las enfermedades y por qué ello es importante; segundo, cómo la disminución en el número de podocitos conduce a proteinuria y glomeruloesclerosis; tercero, lo que ocupará la mayor parte del tiempo, las causas clínicamente relevantes que producen disminución en el número de podocitos; y finalmente, la posibilidad de evitar la disminución del número de podocitos, mediante terapias que actualmente están en desarrollo.

El podocito, esta hermosa célula altamente diferenciada, puede sufrir daño por mecanismos inmunológicos y no inmunológicos; cualquiera de ellos dará origen, en último término, a proteinuria, por lo general en rangos nefróticos, con o sin síndrome nefrótico. Esto sucede en la nefropatía de cambios mínimos, la glomeruloesclerosis primaria o secundaria a toxinas, las infecciones, las enfermedades metabólicas como la diabetes, y las enfermedades genéticas o hereditarias. Independientemente de la causa, el podocito responde siempre de la misma manera: cuando se produce la lesión se liberan ciertas citoquinas, como TGF-beta (Transforming Growth Factor) y especies oxígeno reactivas, que causan un aumento de la producción de proteínas de la matriz extracelular, con el consiguiente engrosamiento de la membrana basal del glomérulo, tal como se ve en la nefropatía membranosa y la nefropatía diabética.

Ya se discutió sobre el borramiento del podocito. Ahora se analizará el número de células y otras modificaciones que ocurren en ellas. La reducción en el número de podocitos es importante, porque varios estudios demuestran que existe correlación entre el número de estas células y la proteinuria, y entre la reducción en el número de podocitos y el desarrollo de glomeruloesclerosis.

Disminución del número de podocitos, proteinuria y esclerosis

Los estudios en modelos animales de nefropatía membranosa, realizados por nuestro grupo, han demostrado claramente que existe una correlación directa entre el aumento de la proteinuria y la disminución del número de podocitos. La proyección de esto hacia la clínica se ha estudiado en pocos trabajos; en uno de ellos, en el que se analizó la correlación entre el número de podocitos y la albuminuria en pacientes con diabetes tipo II, se observó que, a medida que el número de podocitos disminuía, la albuminuria aumentaba. Lo mismo se demostró en pacientes con diabetes tipo I, que tenían las células endoteliales y mesangiales en número normal, pero presentaban disminución del número de podocitos, lo que se correlacionaba con la intensidad de la proteinuria. También existe correlación con la esclerosis: a medida que disminuye el número de podocitos, aumenta la proteinuria y aumenta la esclerosis. La explicación de esto es bastante simple: si se pierden podocitos, la barrera de filtración, también conocido como diafragma de filtración, comienza a fallar, con lo que se pierde la resistencia al paso de las proteínas hasta que se llega al punto en que la albúmina, simplemente, se escapa.

En cuanto a la cicatrización, es decir, la esclerosis, existen múltiples estudios en animales, entre los que se destaca el trabajo experimental de Roger Wiggins, que tuvo varios hallazgos interesantes. En un modelo de nefropatía por puromicina, este autor correlacionó el porcentaje de podocitos normales con la intensidad de la esclerosis; encontró que cuando el número de podocitos baja a menos de 80% de lo normal, comienza a haber cicatrización; y a medida que disminuye el número de podocitos, la cicatrización es cada vez mayor (Kidney International (2001) 60, 957–968).

Hogg habló extensamente sobre la nefropatía por IgA como enfermedad del mesangio, pero es interesante mencionar el trabajo de Kevin Lemley sobre la importancia del número de podocitos en las enfermedades mesangiales. Correlacionando el número de podocitos con la intensidad de la esclerosis y la VFG en la nefropatía por IgA, observó que, a medida que disminuía el número de podocitos, aumentaba claramente la esclerosis. Lo mismo observó en la esclerosis focal, la nefropatía diabética y la nefropatía membranosa: en todos estos casos, a menor número de podocitos, mayor es la proteinuria y más intensa es la esclerosis (Kidney International (1998) 54, 687–697).

La explicación de esto es que una de las funciones de los podocitos es mantener la integridad del ovillo capilar glomerular; es importante recordar que es una célula muy activa, que se ubica encima, por fuera, de la membrana basal glomerular, donde se opone a la presión hidrostática intracapilar y actúa como barrera, evitando la protrusión del ovillo capilar. Al disminuir el número de podocitos, no sólo se pierde el efecto de barrera para el paso de las proteínas, sino que la presión dentro del ovillo capilar, que con frecuencia está aumentada en la patología glomerular, ya no tiene oposición; de esta manera se empiezan a producir protrusiones del ovillo capilar, las que condicionan adherencias sinequiales que son el inicio de la esclerosis focal. Se produce hialinosis y, por último, esclerosis. Esta secuencia de fenómenos, que explica la esclerosis por reducción del número de podocitos, ha sido demostrada por Kriz, Rennke y otros (J Am Soc Nephrol) 13:3005-3015, 2002.

Causas de la reducción del número de podocitos

El número de células de una población es un reflejo del equilibrio entre la proliferación y la pérdida de células. Las únicas enfermedades en las que hay proliferación de podocitos son la glomerulopatía colapsante y la glomerulonefritis crescéntica; en la nefropatía con cambios mínimos, la nefropatía diabética, la glomeruloesclerosis focal y segmentaria y la nefropatía membranosa, el número de podocitos está normal o disminuido. La disminución en el número se puede deber a menor proliferación, por daños en el ADN o hipertrofia, o a mayor pérdida de células, por desprendimiento o apoptosis. El concepto básico es que hay una alteración del equilibrio que mantiene el número normal de podocitos, lo que conduce a proteinuria y esclerosis.

La menor proliferación de los podocitos se debe en parte a una característica básica de ellos. En una conferencia previa se habló sobre la capacidad de proliferación de las células mesangiales. El podocito tiene como característica que no prolifera; de hecho, como ya se señaló, en la mayoría de las patologías el número de podocitos está normal o disminuido, y que son contadas las enfermedades en las cuales se produce proliferación de ellos. Para explicar por qué, en oposición a la célula mesangial, que prolifera con gran facilidad, el podocito no prolifera, nosotros planteamos la hipótesis de que en el podocito podrían estar aumentados uno o más inhibidores del ciclo celular, ya que si una célula tiene inhibido algún paso de este ciclo, no podrá proliferar. En colaboración con Charlie Alpers, observamos la expresión de los inhibidores de ciclo celular en el glomérulo humano normal; y encontramos que en los podocitos hay abundante p27, pero no p21. Resumiendo diez años de trabajo e integrando experimentos en animales, cultivos de tejido, experimentos con knock-out, cepas transgénicas y datos de estudios en humanos, pensamos que estos factores, aislados o en combinación, son claves para determinar si la célula sigue una vía de proliferación o de no proliferación. En estas patologías habría un aumento de estos inhibidores, de modo que el ciclo celular se detiene y los podocitos no proliferan; por el contrario, si hay una reducción en los factores inhibidores, el podocito prolifera. La ausencia de proliferación es nociva para estas células y, en último término, es la causa de la enfermedad, ya que la incapacidad de proliferar condiciona la disminución en el número de podocitos.

El daño del ADN, que es otro mecanismo que impide la proliferación, constituye un área de investigación muy interesante. Es obvio preguntar por qué se daña el ADN en el podocito: los inhibidores de proliferación actúan fundamentalmente evitando la síntesis de ADN. La otra interrogante es, por qué el bloqueo de la mitosis en el podocito es completamente diferente al de la célula mesangial. Se sabe que, si las células se exponen a agentes que dañan el ADN, como la radiación UV, el ciclo celular se detiene en G2 y las células no entran en mitosis. Entonces se hizo el experimento de poner podocitos en cultivo y agregarles anticuerpos, en presencia y en ausencia de suero. En el primer caso hubo una lesión benigna, sublítica, por C5; y en el segundo no hubo lisis. La pregunta a contestar era si hay o no daño al ADN: la conclusión final, usando éste y otros métodos adicionales, es que el daño del podocito mediado por complemento produce siempre grados variables de lesión del ADN, mientras que las células mesangiales expuestas a agresiones similares no sufren daño del ADN; éste es un fenómeno selectivo del podocito.

Para comprobar si esto también ocurre in vivo, se utilizó el modelo de nefritis membranosa pasiva; y se encontró que el daño del ADN estaba presente, tanto en el modelo animal como en los cultivos celulares, lo que se ha comprobado repetidamente en diferentes modelos; Caroline Marshall, de mi grupo, demostró la presencia de daño del ADN en la enfermedad de cambios mínimos. También se pudo demostrar que el daño es oxígeno-dependiente, al menos en parte, ya que al bloquear la oxidación este daño disminuyó significativamente. En la actualidad hay muchas investigaciones en curso, no sólo con lesiones mediadas por complemento, sino también con otras formas de agresión al podocito.

En resumen, hasta ahora se puede considerar que hay daño del ADN y aumento de uno o varios inhibidores del ciclo celular; y que todos estos factores le indican al podocito, pero no a la célula mesangial, que debe detener su proliferación y no debe dividirse. En la mayoría de las situaciones hay condiciones locales que le ordenan al podocito que no prolifere, lo que se puede deber a que es una célula muy sofisticada, que para dividirse se debe des-diferenciar, con lo cual pierde su funcionalidad normal. Esto sucede a expensas de la proteinuria y la glomeruloesclerosis. El equilibrio entre proliferar o no proliferar es extremadamente fino, pero el mensaje central es que la falta de proliferación se debe a la presencia de inhibidores que afectan la síntesis de ADN; además, hay daño del ADN y alteración de diversas vías de transmisión de señales. Todo esto hace que el podocito no sea capaz de entrar en mitosis y el resultado final es la falta de proliferación del podocito, una situación completamente diferente a la de la célula mesangial.

El aumento de la pérdida celular también es una causa de la reducción del número de podocitos, como lo demuestra la evidencia disponible sobre el desprendimiento (detachment) de los podocitos y su apoptosis. Es obvio que si hay mayor desprendimiento, o más muerte celular, habrá menos células y, por ende, disminución del número de podocitos. La pérdida de podocitos por desprendimiento ha sido estudiada por el grupo de Kevin Lemley y otros, incluyendo el nuestro, mediante la búsqueda de podocitos en la orina, en ciertas enfermedades humanas. En pacientes con glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS) activa, definida como tal por la proteinuria, se encuentran podocitos en la orina, a diferencia de lo que ocurre en la FSGS inactiva. También en la nefropatía lúpica, si el lupus está activo, definido por la proteinuria, aparecen podocitos en la orina.

La simple pregunta que se planteó fue, si estos podocitos presentes en la orina estaban vivos o muertos, es decir, si eran células muertas que estaban siendo eliminadas, o eran células viables que se desprendían y caían a la orina. Para responder a esto estudiamos nefropatía membranosa experimental, nefropatía diabética experimental, glomerulonefritis crescéntica y otros modelos; y se encontraron células viables, que expresan podocina, nefrina y todos los marcadores proteicos. Lo más interesante, tanto en los modelos animales como en los estudios que se están haciendo actualmente en humanos, es que estos podocitos aislados de la orina, al ser colocados en placas de cultivo, se asientan y crecen normalmente. Esta capacidad de crecer in vitro permitirá estudiar las condiciones ambientales que impiden su proliferación. En ninguno de los modelos estudiados se han encontrado células mesangiales, endoteliales ni tubulares.

En suma, los podocitos se desprenden estando viables. En seres humanos, tanto en la diabetes tipo I como en la tipo II, hay disminución del número de podocitos por desprendimiento, al igual que en los modelos experimentales. Los estudios en cultivos celulares realizados por nuestro grupo demuestran que el desprendimiento es causado por la glucosa: lo más probable es que in vivo suceda lo mismo, al menos según los estudios experimentales que se han realizado hasta ahora; es decir, de alguna manera la glucosa hace que los podocitos se desprendan. La investigación actual se orienta a comprender el mecanismo del fenómeno y cómo se podría enfocar desde el punto de vista terapéutico. Algunos posibles candidatos son las integrinas, moléculas mediadoras de la adhesión del podocito a la membrana basal; kinasas ligadas a integrinas; proteínas de la matriz; vías de transmisión de señales y toda una constelación de posibles candidatos que podrían estar alterados en la diabetes y en otras enfermedades. Sobre todos ellos hay actualmente trabajos en desarrollo.

La pérdida de podocitos por muerte celular es el principal mecanismo de pérdida de podocitos, según lo que se dilucidado en los últimos años. Al considerar la muerte celular, nuevamente surge el concepto del equilibrio entre los factores que mantienen la viabilidad de las células y los factores que potencian la muerte celular: el equilibrio entre estos factores es el que determina si la célula vive o muere. Bowen y su grupo fueron los primeros en demostrar que el TGF-beta, que se consideraba sólo como un factor de crecimiento pro-fibrogénico, en realidad induce la apoptosis de los podocitos. Nuestro grupo analizó los mecanismos intranucleares y demostró que en los podocitos expuestos a TGF-beta, en cultivo, había un marcado aumento de p21, y cuando la célula tiene aumentada la expresión de p21 muere cuando se expone a agresión por complemento y por diversos otros agentes de daño. No muere si el p21 no está expresado. Para resumir, el p21 es un importante regulador de la muerte celular.

La ciclina-1 es una proteína que se expresa constitutivamente en el podocito y que ha sido motivo de los estudios más recientes, todos muy interesantes, debido a su posible papel en la protección contra la muerte de la célula. Nuestro grupo desarrolló ratones knock-out para ciclina- I y los provocó con diferentes anticuerpos, lo que permitió comprobar que es una proteína nueva, específica del podocito y que protege selectivamente contra la muerte celular.

Como ya se señaló, el aumento de la glucosa extracelular produce disminución del número de podocitos, lo que, según las investigaciones, no se debe solamente a desprendimiento de los podocitos, sino también a un efecto directo que ocasiona la muerte celular. Otros grupos también han demostrado esto y actualmente estamos trabajando para dilucidar el mecanismo.

Ya se ha señalado la importancia de las proteínas del diafragma de hendidura; ahora es el momento de mencionar que la nefrina y la CD2AP, que se ubican en este diafragma, son importantes no sólo para evitar la salida de proteínas, sino que juegan un papel en la sobrevida del podocito. Varios grupos, además del nuestro, han demostrado que si se manipula este sistema la célula se hace más vulnerable a la muerte celular; Thomas Benzing demostró que ello se debe a la actividad de la PI3K/AKT. Lo importante es que estas proteínas no sólo tienen un papel fundamental como barrera de filtración, sino que ellas, de alguna manera, le dicen al podocito que siga vivo. Ahora que se conoce el mecanismo se puede decir que es muy coherente que sea el diafragma de hendidura, que tiene muchas funciones, el que le dicte a la célula lo que debe hacer. Por otra parte, se sabe que si hay alteraciones de la nefrina o de la CD2AP, hay borramiento de los podocitos y proteinuria. Ése es otro mecanismo: cuando hay reducción de esas proteínas, la célula muere; al morir, disminuye su número y aparece proteinuria.

Existe abundante literatura sobre la investigación, que está en pleno desarrollo, sobre el fenómeno de la muerte celular del podocito, en especial sobre los factores que se relacionan con la sobrevida y la muerte. Dentro de estos factores, está claro que la CD2AP, la nefrina, el VEGF y la ciclina-I favorecen la sobrevida del podocito, mientras que el TGF-beta, la angiotensina II y el receptor subtipo 1 se relacionan con su muerte. El equilibrio entre estos factores determina la sobrevida o la muerte celular y, en último término, determina el número de células.

Terapias dirigidas a evitar la disminución podocitaria

La lista de sustancias que inhiben la apoptosis de los podocitos es extensa, de modo que no es posible revisarlas todas en tan corto tiempo. En esta presentación se hará análisis somero de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA), la dexametasona y el ATRA

En cuanto a los IECA, se sabe que la inhibición de la angiotensina (AT), mediante IECA o bloqueadores del receptor de AT, disminuye la proteinuria, y que esta se debe, en parte, a la reducción de la presión arterial y en parte, a la reducción de la presión intraglomerular. En la actualidad, la literatura está entregando cada vez más evidencias de que la AT II y el receptor subtipo 1 están aumentados, por ejemplo, en la diabetes y en la elongación mecánica de los podocitos, a través de una vía local, intrínseca, de novo. La AT causa modificaciones en el calcio y en el AMP cíclico y produce hipertrofia, reordenamiento de actina y borramiento; y en lo que se refiere a la apoptosis, la AT II produce directamente una disminución del número de podocitos. Exista o no diabetes, la AT que existe a nivel local se une al receptor subtipo 1 y uno de los efectos colaterales de esto es la muerte celular y la disminución en el número de podocitos. Cuando se usan IECA a largo plazo, es probable que otro mecanismo de acción, independiente de la baja de la presión arterial y de la presión intraglomerular, sea el efecto sobre el número de podocitos.

Los corticoesteroides son medicamentos que se utilizan mucho, por lo que es importante determinar si protegen de alguna manera al podocito, más allá de su efecto sobre el sistema inmune. Datos recientes, que pronto serán publicados, fueron aportados por Takehiro Wada, de nuestro grupo, a partir de estudios in vivo, que complementaron lo descrito por otros autores que han trabajado en cultivos celulares de podocitos expuestos a la acción tóxica de la puromicina. Nosotros utilizamos varios otros estímulos y observamos que al exponer a las células a este tipo de agresión, aumenta la muerte celular; pero si se agrega dexametasona, además de puromicina, la apoptosis de los podocitos se reduce significativamente. Analizando el mecanismo y las posibles vías, se encontró que la puromicina aumenta la expresión el gen supresor de tumores p53, lo que se relaciona con apoptosis; la adición simultánea de dexametasona evita el aumento de p53, y, por lo tanto, la muerte celular. Existen otras vías a través de las cuales los corticoides podrían proteger a los podocitos. Cuando se administra puromicina, el factor inductor de apoptosis, que normalmente está presente en el citoplasma, se mueve desde el citoplasma hacia el núcleo y la célula muere; si se administra conjuntamente dexametasona, el factor inductor de apoptosis permanece en el citoplasma, lo que demuestra que, más allá de sus efectos inmunológicos, la dexametasona tiene efectos pleiotrópicos, bloqueando al menos dos de las vías que conducen a la apoptosis del podocito, a saber, la sobreexpresión de p53 y la translocación nuclear del factor inductor de apoptosis. Todo esto tiene importancia clínica.

El ácido transretinoico (ATRA), un derivado de la vitamina A que se usa para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica y al que no se le suponía ningún efecto relacionado con el podocito; según datos obtenidos por Michael Vaughan, sí lo tiene. En un modelo experimental se indujo lesión de los podocitos, provocando intensa apoptosis; si a los animales se les administraba simultáneamente ATRA, la apoptosis se reducía en forma significativa, con restauración del número de podocitos, tanto en el día 7 como el día 14. Con base en estos estudios, Jeff Coppen, del NIH, está llevando a cabo estudios clínicos en los que se está administrando ATRA a pacientes con nefropatía membranosa resistente. Al parecer, esta sustancia actúa directamente, evitando la muerte celular

Existen muchas otras vías nuevas, muy interesantes; por ejemplo, hay datos excelentes, que serán presentados ante la American Society of Nephrology (ASN), que demuestran la acción de la eritropoyetina, que se creía relacionada solamente con los glóbulos rojos, como un factor directo de supervivencia de los podocitos. Los antioxidantes y el VEGF tienen un papel similar. En el futuro, cuando se plantee el manejo clínico de estos pacientes no sólo se deberá pensar en la forma de disminuir la presión intraglomerular y la presión arterial sistémica, sino también en la posibilidad de intervenir directamente sobre la respuesta a la lesión, evitando la apoptosis, mediante alguna de estas nuevas posibilidades.

Conclusiones

El número de podocitos es muy importante para la función renal normal. En la gran mayoría de las patologías, aunque no en todas, estas células están reducidas en número, lo que se puede deber a que no proliferan, sea por alteración en la síntesis de DNA, debido a presencia de inhibidores de la ciclo-kinasa, o por detención de la mitosis, secundaria a daño del DNA; alternativamente, o quizás al mismo tiempo, puede haber un aumento en la pérdida de podocitos, sea por desprendimiento de células viables o por aumento de la muerte celular. Independientemente del mecanismo, la disminución del número de podocitos conduce a proteinuria y glomeruloesclerosis y, en último término, a deterioro de la función renal.

Lo expuesto tiene gran importancia para la clínica, porque ya no habrá que conformarse con mirar la biopsia renal y observar qué aparece, sino que se podrá hacer una evaluación más activa, mediante la determinación de la cantidad de podocitos en la orina; el resultado que se obtenga se podrá utilizar como potencial indicador de actividad de la enfermedad, o como factor pronóstico, para decidir cuándo corresponde usar citotóxicos o prednisona. Es un campo prometedor y fascinante, en el cual aún hay mucho trabajo por hacer.

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