Resumen

Introducción

Esta conferencia se enfocará en la célula mesangial y los hallazgos obtenidos en los estudios de esa célula en particular, en el contexto de los estudios del ciclo celular.

La estructura del glomérulo está conformada por cuatro tipos de células. Cuando se habla de enfermedad glomerular, los médicos cuya actividad predominante es la clínica piensan en síndrome nefrótico o nefrítico; pero además se puede pensar específicamente en el tipo de célula que está afectada en cada caso: el podocito, en esclerosis focal, nefropatía con cambios mínimos, diabética, membranosa y amiloidosis; la célula mesangial, en un grupo de enfermedades diferentes, como nefropatía por IgA, nefropatía por IgM, nefropatía diabética, amiloidosis, lupus y otras; la célula endotelial, que está afectada en patologías como glomerulonefritis (GN) membranoproliferativa, lupus, microangiopatía trombótica y GN postestreptocócica; la célula parietal epitelial, aunque no está directamente dañada, participa como parte fundamental en las crecientes (semilunas). Lo importante es que, al considerar las enfermedades glomerulares en la clínica, se debe pensar en cuál tipo de célula está afectado en cada una de ellas y cuál es su sello histológico, porque frente al daño de cada una de estas células, la respuesta a la lesión es muy diferente. Esta respuesta puede consistir en proliferación, hipertrofia, apoptosis y desdiferenciación.

La célula mesangial es diferente del podocito y algo diferente de la célula endotelial. Cuando la célula mesangial sufre una lesión, responde, bajo ciertas condiciones, proliferando rápidamente; bajo otras condiciones va a la hipertrofia y, bajo otras, sufre apoptosis o bien, se desdiferencia y adopta un fenotipo de célula miofibroblástica. El podocito, característicamente, no prolifera y puede ir a la hipertrofia o a la apoptosis. La célula endotelial ha sido menos estudiada, pero se sabe que prolifera y que puede morir, l que, de hecho, ocurre; no se sabe si puede ir a hipertrofia o desdiferenciación.

Introducción al ciclo celular

El estado de reposo celular se denomina fase G0. Ante determinados estímulos, la célula entra en ciclo celular fase G1, que la prepara para la siguiente fase del ciclo, la fase S, donde ocurre la síntesis de ADN. La sigue la fase G2, que prepara a la célula para la fase final del ciclo, llamada M o mitosis. A esta sigue la etapa de citocinesis o división celular, la cual, en sentido estricto, no forma parte del ciclo celular.

En la actualidad se sabe, gracias al trabajo que ameritó que se otorgara el Premio Nobel de Medicina a Leland Hartwell, de Seattle, que una célula que está en G0 llega a la fase M gracias a las kinasas ciclina-dependientes, también llamadas CDK, cuyo nombre se debe a que hay diferentes ciclinas que activan a estas proteínas celulares. En cada fase del ciclo hay diferentes ciclinas, que ligan y activan diferentes kinasas. Si esto no estuviera regulado habría un verdadero desastre de proliferación, como sucede en el cáncer; pero la naturaleza ha diseñado un conjunto de proteínas, llamadas inhibidores de las ciclino-kinasas que, como lo indica su nombre, bloquean las ciclinas que activan a las kinasas ciclina-dependientes y se designan según el peso molecular de cada proteína: p21, p27, p57. Esencialmente, que la célula prolifere o no depende del equilibrio entre las ciclinas, las kinasas ciclina-dependientes y sus inhibidores.

Los estudios en este campo sólo se referían a proliferación, ya que, tradicionalmente, se piensa en ciclo celular en el contexto de la proliferación celular; no se sabía por qué el podocito no tiene síntesis de ADN y por qué en estas células hay disminución de la mitosis. Como se sabe, el podocito no prolifera, excepto en la GN colapsante, que no es objeto de esta exposición. Por eso decidimos investigar nuevas funciones del ciclo celular, más allá de la proliferación. El ciclo celular gobierna la hipertrofia y tiene un papel muy activo en la apoptosis de la célula mesangial; al hablar de ciclo celular hay que pensar que comprende no solamente la proliferación, sino también la participación en los fenómenos de hipertrofia y apoptosis y en el gobierno de la diferenciación celular. En esta oportunidad se hablará de la proliferación, hipertrofia y apoptosis de la célula mesangial.

Proliferación de la célula mesangial

Lo que más destaca en la histología clásica de una nefropatía por IgA avanzada es la gran cantidad de células que, con tinción adecuada, corresponden a células mesangiales; además, hay un gran aumento de proteínas de la matriz extracelular, que se tiñen de rosado. De esta observación surgió el interés por saber, porqué hay tantas células mesangiales en esta nefropatía. En respuesta a una injuria, la célula mesangial prolifera y esto, de alguna manera que aún no se comprende, podría causar el aumento de la matriz extracelular. Las células sufren diferenciación miofibroblástica y, en la fase reversible del daño, al menos una parte de ellas van a la apoptosis. Todos estos fenómenos están estrechamente relacionados entre sí.

La proliferación de las células mesangiales preocupa, porque, si no se controla, siempre conduce a un aumento de matriz extracelular y a glomeruloesclerosis; si se lograra detener de alguna manera la proliferación de estas células, se podría detener el proceso y evitar la glomeruloesclerosis. Este raciocinio condujo a preguntar: ¿Es posible detener la proliferación de la célula mesangial actuando a nivel de ciclo celular? Si ello es así, ¿se puede, por intermedio de esto, detener la acumulación de matriz extracelular y lograr la resolución del proceso? Con el objetivo de llevar nuestros hallazgos a la clínica, exploramos el papel que desempeña la CDK2 en la proliferación de la célula mesangial, utilizando para ello el modelo Thy-1 en ratas, que es excelente, porque la célula mesangial de la rata expresa un antígeno llamado “antígeno 5-1”. Si a los animales se les administran anticuerpos contra este antígeno, se desarrolla una lesión muy similar a la nefropatía por IgA, con proliferación mesangial, aumento de síntesis de ADN, aumento de niveles de CDK2 y también aumento de las proteínas.

El paso siguiente fue intentar bloquear la CDK2 con un inhibidor de moléculas pequeñas; en este caso se utilizó un compuesto llamado roscovitine, uno de los muchos inhibidores de moléculas pequeñas disponibles. A raíz de nuestro trabajo, la empresa Genzime tiene este compuesto actualmente en estudio clínico fase 3, para su comercialización como inhibidor de proliferación mesangial. Lo que hace, básicamente, es inhibir la CDK2, que es esencial para la síntesis de ADN. En nuestro modelo, las ratas que recibían el inhibidor de CDK2 mostraron una disminución sustancial en la síntesis de ADN y, a la histología, la celularidad era mucho menor.

Como ya se dijo, hay una correlación clara entre la proliferación mesangial y la acumulación de proteínas de la matriz. Por eso, la siguiente pregunta a responder fue, si el bloqueo de la CDK2 podría mejorar la función renal y prevenir la glomeruloesclerosis. La respuesta es que sí: en nuestros animales, la tinción para colágeno y laminina mostró menor acumulación de matriz, lo que se acompañó de menor proteinuria y menor grado de esclerosis a lo largo del tiempo. Con el pensamiento orientado hacia nuestros pacientes, nos interesaron todas las CDK, aunque sólo he presentado algunos de nuestros resultados, en los cuales el knock-out de la CDK2 disminuye considerablemente la lesión glomerular y el progreso de la patología. Muchos otros grupos están estudiando diferentes inhibidores de moléculas pequeñas, y, fuera de la ya mencionada Genzime, otras empresas están realizando estudios clínicos que se encuentran en diversas fases de progreso, en centros europeos y americanos. Es una esperanza terapéutica real para la clínica.

Apoptosis de la célula mesangial

El aspecto del ciclo celular activo en la apoptosis es novedoso, porque el ciclo celular se relacionaba siempre con proliferación y resulta extraño asociarlo con muerte celular. El número de células mesangiales es resultado del equilibrio entre su proliferación y su muerte. Si hay exceso de proliferación, habrá un aumento en el número, como es característico en la nefropatía por IgA; si, por el contrario, aumenta la apoptosis, como sucede en el riñón remanente y probablemente en la diabetes, habrá una disminución en el número de células, lo cual también es perjudicial.

Gran número de trabajos, experimentales y en humanos, demuestran que cuando hay proliferación, generalmente hay también apoptosis, lo que llevó a plantear la posibilidad de que el ciclo celular en la célula mesangial cumpla algún papel más allá de lo que generalmente se piensa, es decir, en la multiplicación; en otras palabras, si el ciclo celular, de alguna manera, regula no sólo la proliferación, sino también la muerte celular por apoptosis. Esta posibilidad está en estudio por nuesro grupo desde hace bastante tiempo, pero esta presentación se enfocará en un solo aspecto: la proteína conocida como p27, un inhibidor cuyo nombre se refiere a su peso molecular y que es de especial interés, porque se expresa constitutivamente en la célula mesangial.

Las células mesangiales normales en reposo están rodeadas de gran cantidad de p27, como lo demostró el análisis de Western Blot en glomérulos de ratas y humanos; pero en el modelo Thy-1, junto con la proliferación de las células mesangiales se observó que había una cantidad importante de muerte celular y que los niveles de p27, así como la inmunotinción para esta proteína, disminuían significativamente a medida que aumentaban la proliferación y la apoptosis. En ese momento se pensó que tal vez la p27 tenía un papel sólo en la proliferación, pero quizás podría haber algo más. En colaboración con Roberts, nuestro grupo indujo enfermedad en ratones con knock-out de p27 y en ratones normales y encontró que la proliferación celular estaba aumentada en los animales con knock-out p27, en comparación con los ratones normales, lo que no era tan imprevisto. Lo interesante fue que en los ratones con knock-out había un significativo aumento de la apoptosis de las células glomerulares, en comparación con los animales normales. Se repitió lo mismo en varios otros modelos animales y siempre el paradigma se mantuvo: al bajar los niveles de p27 aumentaba la muerte celular, fenómeno independiente de la proliferación.

Los anterior condujo a plantear la hipótesis de que la proteína p27, inhibidora de CDK, está normalmente presente en la célula mesangial y puede protegerla de la apoptosis, independientemente de su papel en la proliferación celular. Este territorio estaba inexplorado hasta ese momento y al comienzo hubo mucha oposición por parte de los revisores de las revistas, como sucede siempre que aparece algo nuevo. Al fin logramos convencerlos, con una gran cantidad de datos, algunos de los cuales presento aquí.

La investigación continuó con el cultivo celular de células de animales con p27 normal y animales knock-out para p27. Cultivadas en suero las células crecen contentas, pero si se las priva de factores de crecimiento, decaen y dejan de crecer; el número de células normales disminuye, pero las células de animales knock-out disminuyen mucho más. Esto apoya la idea del papel de la p27 como protección contra la muerte celular. Para comprobar la hipótesis, se reintrodujo la proteína p27 en las células knock-out, es decir, se reconstituyeron las condiciones normales y se demostró que la reconstitución de p27 hace que se igualen los niveles de apoptosis con los de las células normales, es decir, las protege. En resumen, cuando hay una lesión de la célula mesangial, disminuye la expresión de la proteína p27, lo que puede llevar a proliferación o bien a la muerte celular, por activación de las vías de apoptosis. Creemos que en realidad son independientes.

La siguiente pregunta era: ¿De qué manera la p27 protege a la célula de la muerte? Como siempre sucede cuando se plantea una interrogante nueva, cuando se revisa la literatura antigua se encuentra que alguna vez alguien ya lo hizo, y fue olvidado. La observación de que la apoptosis y el ciclo celular están estrechamente relacionados, sólo era un redescubrimiento de la pólvora. En nuestros estudios se observó que la mayoría de las células que van a la apoptosis, aunque no todas, entran primero al ciclo celular y lo abandonan; es decir, las células más vulnerables a la muerte celular son las que proliferan, como las células mesangiales. Se planteó la hipótesis de que, como la p27 inhibe el ciclo celular, es posible que tenga algo que ver con la CDK2 y así no sólo permite que las células proliferen, sino que evita que abandonen el ciclo celular para morir. Para comprobar esto se realizó análisis de Western Blot en células mesangiales en proliferación, apoptóticas y en reposo para determinar, entre otras sustancias, CDK2 y su compañera, la ciclina A. En la célula en reposo hay muy poca proteína CDK2 y poca ciclina A, sólo niveles basales; cuando la célula prolifera se produce un marcado aumento de ambas proteínas. Lo que se demostró por primera vez fue que en la células apoptóticas también hay aumento de la CDK2 y de la ciclina A; de pronto, la p27 y la CDK2 aparecían con un papel doble, en la proliferación y en la apoptosis.

La hipótesis que se plantea es la siguiente: cuando hay una lesión de la célula mesangial se activa la ciclina-E-CDK2, seguida de la ciclina A-CDK2, y la célula prolifera, lo que constituye la secuencia normal de fenómenos; en contraste, si las células se estimulan de cierta manera y se activa la ciclina A, sin la activación inicial de la ciclina E, la célula toma la vía de la muerte celular. Esto se comprobó inhibiendo o activando las vías. Así, el ciclo celular se transforma en algo fascinante: no sólo gobierna la proliferación, sino que también gobierna la apoptosis, ambas estrechamente conectadas. En resumen, el daño a la célula mesangial se asocia con frecuencia a disminución de la proteína p27, lo que a su vez se asocia con activación de la kinasa ciclino dependiente CDK2 y, si la que actúa es la proteína correcta, la célula toma el camino de la proliferación; pero si se activa la proteína incorrecta, toma la vía de la muerte celular. Esto podría explicar por qué la proliferación y la apoptosis están tan estrechamente relacionadas en muchas células: porque la misma proteína cumple un doble papel.

Cuando el brillante investigador Keiju Hiromura, de Japón, visitó nuestro laboratorio, se le planteó que la apoptosis es un asunto genético; que la síntesis de ADN es un fenómeno nuclear y la apoptosis comienza en el citoplasma; y que si la CDK2 está en el núcleo y hace lo que debe hacer, esto es, participa en la síntesis de DNA, todo será normal, pero si está en el sitio equivocado dentro de la célula, enviará a ésta a la vía de la muerte celular. Posteriormente Hiromura trajo datos muy interesantes que apoyaban esta hipótesis. Nuestro grupo aplicó inmunotinción en células indemnes, con lo que se pudo ver la CDK2 en el núcleo; y se comprobó que si se dañan las células con radiación UV, fas, como se hizo en esre caso, TGF-beta o cualquiera de los gatillantes, se producía una movilización de la CDK2 hacia el citoplasma, lo que coincidía con el inicio de la muerte celular. Lo mismo sucedía con la ciclina-A, una de las proteínas que activa la CDK2. Cuando esto ocurría demasiado precozmente, enviaba a la célula hacia la apoptosis. A diferencia de la célula en proliferación, en la cual la ciclina A está en el núcleo, en la célula dañada se observa también en el citoplasma, es decir, hay una traslocación de la proteínas desde el núcleo. No basta con demostrar la presencia de las proteínas, hay que demostrar la actividad del complejo ciclina A-CDK2.

Luego se aislaron las proteínas desde el núcleo y desde el citoplasma, se realizó el análisis de actividad y se encontró que, en la célula en proliferación, cómo se podía prever, la CDK2 estaba muy activa en el núcleo y muy poco, o nada, en el citoplasma; en cambio, cuando la célula estaba dañada, la CDK2 estaba tan activa en el citoplasma como en el núcleo. Es decir, si se activa en el lugar y el momento equivocados, envía la célula a la vía de la muerte celular. Esto no fue suficiente para los revisores, pero los revisores estrictos son útiles, porque empujan al investigador a avanzar más y más.

El siguiente paso era microinyectar CDK2 en el citoplasma y en el núcleo, para ver lo que ocurría. Utilizando ciclina A- CDK2 recombinante, Hiromura demostró que, al inyectarla en el citoplasma, la célula iniciaba el proceso de muerte; en cambio, si se inyectaba en el núcleo, la célula proliferaba.

Para resumir lo presentado hasta ahora, que está respaldado por muchos datos y sigue siendo una línea de investigación en curso, se puede decir que cuando el complejo ciclina A-CDK2 está en el lugar debido, el núcleo, hay proliferación celular, pero si se transloca al citoplasma y se activa, se gatilla la muerte por apoptosis. Actualmente estamos trabajando para dilucidar lo que sucede río abajo, es decir, qué fenómenos intracelulares se desencadenan para producir el efecto de la CDK2. También estamos estudiando el mecanismo de la translocación, si participa la p53 o si hay alguna proteína que actúa como un trampolín sobre el cual la ciclina atraviesa la membrana nuclear. Aún no hay datos al respecto.

Hipertrofia de la célula mesangial

Se sabe que el sello característico de la nefropatía diabética es la expansión del mesangio, aunque hay que aclarar que la diabetes no es, probablemente, una enfermedad de la célula mesangial, sino del podocito. Lo claro es que en la mayoría de los diabéticos los glomérulos son grandes; y si se observa con cuidado, se puede ver que la expansión mesangial se debe, por una parte, a aumento de matriz extracelular y por otra, a aumento del tamaño de las células. Muy pocos estudios demuestran aumento del número de células mesangiales; incluso, habitualmente, el número de células está disminuido. La interrogante es: ¿Por qué las células mesangiales están más grandes? Este proceso, llamado hipertrofia, por el que una célula aumenta de tamaño, se debe a que hay aumento de proteínas y de ARN, sin haber replicación del ADN.

Cuando una célula quiescente entra en ciclo celular, en G1, comienza a sintetizar muchas proteínas, porque más adelante habrá síntesis y replicación del ADN, la célula entrará en mitosis y se dividirá, de modo que debe aumentar de tamaño, para poder dividirse en dos, por eso, en el comienzo del ciclo celular hay una síntesis proteica muy activa. La hipótesis que se propuso es que, si el ciclo celular se bloquea por acción de alguno de sus inhibidores, no habría síntesis de ADN ni división, pero la célula quedaría aumentada de tamaño, hipertrófica. A continuación se mostrarán algunos resultados de nuestros estudios sobre el papel que juegan p21 y p27 en la hipertrofia glomerular diabética, sólo para dar una idea general de la dirección en que van los estudios que están en desarrollo en la actualidad. El estudio más antiguo que publicó nuestro grupo se concentró en el análisis por Western Blot de p21 en células normales y células hipertróficas por exposición a exceso de glucosa. Se observó que había un claro aumento de ella en las células hipertróficas y lo mismo ocurría con p27; por lo tanto, había un aumento de los dos inhibidores, en contraste con la proliferación mesangial, en la que estaban disminuidos. Esto se correlacionaba con el aumento de tamaño de la célula.

El paso siguiente fue comprobar que la p21 o la p27 son en realidad las causantes de la hipertrofia. Para ello se utilizaron ratones con knock-out de p27 en los que se hizo incorporación de leucina, que es uno de los marcadores para medir síntesis proteica, y se observó que la célula mesangial normal expuesta a hiperglicemia se hipertrofiaba, mientras que la célula procedente del ratón con knock-out carente de p27, no se hipertrofiaba. La pieza final del rompecabezas era devolver lo que le faltaba a la célula knock-out, es decir, transfectar la célula para reconstituir en ella la p27. Esta célula reconstituida, expuesta a hiperglicemia, se hipertrofiaba, y lo mismo ocurría con p21. Es decir, se demostró, en cultivos celulares, que el aumento de la glucosa aumenta la expresión de p21 y p27; que si se eliminan estas proteínas, la célula no se hipertrofia; y que al reponerlas, se hipertrofia.

En modelos animales, se estudiaron ratones con knock-out de p21 y de p27 y con knock-out doble, los que se expusieron a hiperglicemia inducida con estreptozocina, y se observó que en los animales normales expuestos a hiperglicemia, los glomérulos aumentaban de tamaño. Se midió la hipertrofia glomerular con técnicas especiales de imágenes computarizadas. En contraste, en los animales con knock-out, sometidos a iguales condiciones de hiperglicemia, el tamaño de los glomérulos no aumentaba, y no sólo eso, tampoco aumentaba la matriz extracelular ni se desarrollaba proteinuria. Esto ocurría tanto con la p21 como con la p27, lo que significa que cada una de estas proteínas, por separado, participan en la regulación de la hipertrofia y ésta tiene importancia en la matriz y la proteinuria. Esta línea de investiagción está actualmente en curso.

La última pregunta a responder se refiere a si las dos, p21 y p27, se necesitan para la hipertrofia máxima. La respuesta es que sí, ya que en los animales con doble knock-out se observó que ambas son necesarias para la hipertrofia máxima.

Los datos sobre hipertrofia, en resumen, indican que:

• Cuando las células se exponen a hiperglicemia, in vitro o in vivo en condiciones experimentales, entran en ciclo celular, aumentan sus niveles de proteínas y se hipertrofian, es decir, aumentan de tamaño.
• Si aumentan las proteínas p21 y p27, el ciclo celular se bloquea y hay una desviación en el fenotipo; no sólo se detiene la síntesis de ADN, sino que la célula sale del ciclo y mantiene el fenotipo hipertrófico.

Actualmente estamos explorando este aspecto, con miras a establecer por qué aumentan p21 y p27, si es por efecto de transcripción o post traducción, cuáles son las vías que se activan, si el efecto depende de la dosis, etc. La investigación sigue su curso. Por el momento, esto no tiene aplicación en la clínica, ya que no se puede inhibir p21 y p27, pero tiene un potencial importante a futuro, ya que si se puede demostrar que p21 y p27 son selectivas de glomérulo, hay muchas posibilidades de manipular la alteración de la estructura de las proteínas. Sería posible activar y desactivar el sistema.

El ciclo celular es, actualmente, objeto de intensa investigación por parte de diversos grupos, además del nuestro. Como varias empresas farmacéuticas y algunos bioquímicos especializados en moléculas pequeñas se interesan por la manipulación del ciclo celular, esto abre un gran campo nuevo para la nefrología, con la posibilidad de disponer a futuro de diferentes elementos terapéuticos, como los inhibidores de CDK2 que están en estudio.

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